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La volta è divisa in quattro sezioni dedicate a ciascuna delle facoltà dello spirito, rappresentate con allegorie femminili: la Filosofia, la Teologia, la Poesia e la Giustizia. Gli stessi concetti vengono ripresi e approfonditi nelle grandi composizioni sulle pareti sottostanti. Alla Filosofia corrisponde l'opera forse più famosa di Raffaello, la Scuola di Atene, alla Teologia la Disputa del Sacramento, alla Poesia il Parnaso e alla Giustizia le Virtù Cardinali e Teologali e la Legge.

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Nella parte superiore, su di uno zoccolo o di un parapetto, stanno tre figure femminili simboleggianti le virtù. Da sinistra si riconoscono la Fortezza, con l'elmo in testa e con un ramo di rovere , la Prudenza, vestita di verde e bianco con una testa virile che le guarda le spalle tra i capelli, e la Temperanza, che impugna delle redini. La Giustizia, quarta Virtù cardinale, è raffigurata nel medaglione corrispondente sulla volta. Essa, secondo la dottrina platonica elaborata da sant'Agostino, è gerarchicamente superiore alle altre.Il lato destro è occupato dalla scena di Gregorio IX che approva le Decretali. Ambientato davanti a una nicchia con cassettoni a losanga analoga a quella dell'altra scena, vi è legata da un sistema di corrispondenze: un papa contrapposto a un imperatore e il diritto canonico contrapposto a quello civile

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Nel quadro di Poussin compare innanzitutto Apollo, con la testa cinta di alloro, unico personaggio seduto, che sta porgendo una coppa di nettare, la sacra bevanda degli dei, ad un poeta che, secondo alcuni, è Omero. Alla sua destra si allineano le nove muse, mentre in primo piano si dispongono altri poeti (per un totale di nove, compreso Omero che sta bevendo dalla coppa offertagli da Apollo) tutti con la testa cinta di alloro, segno di raggiunta fama e gloria. Ai piedi di Apollo è distesa una fanciulla nuda, che in realtà è l’immagine allegorica di Castalia, la fonte che sorgeva ai piedi del Parnaso, dove gli artisti e i poeti dovevano purificarsi prima di accedere al tempio di Apollo. Nel quadro compaiono infine sei puttini, due in basso e quattro in alto, simmetricamente disposti rispetto all’asse centrale.Tutta la composizione del quadro è ordinata per spazi e allineamenti ben precisi. Ne risulta una composizione simmetrica con una equilibrata distribuzione di figure rispetto all’asse verticale. Anche le singole figure si presentano in posizioni molto composte, senza torsioni o scorci particolari.

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Sulla parete opposta alla Scuola di Atene, in corrispondenza con la Teologia, è l'affresco della cosiddetta Disputa del SS. Sacramento, il cui titolo dovrebbe essere più propriamente quello di Trionfo della Religione. Ai lati della SS. Trinità (con Dio Padre, il Cristo tra la Vergine e S. Giovanni Battista, e lo Spirito Santo disposti in asse al centro) si dispone la Chiesa Trionfante, con patriarchi e profeti dell'Antico Testamento alternati ad apostoli e martiri, seduti in emiciclo sulle nubi. I personaggi sono (da sinistra a destra per lo spettatore): S. Pietro, Adamo, S. Giovanni Evangelista, Davide, S. Lorenzo, , S. Stefano, Mosè, S. Giacomo Maggiore, Abramo, S. Paolo. Sulla terra, ai lati dell'altare su cui domina il SS. Sacramento, si dispone la Chiesa Militante. Sui troni di marmo più vicini all'altare siedono quattro Padri della Chiesa latina: S. Gregorio Magno tratti di, S. Girolamo, S. Ambrogio e S. Agostino.

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la Stanza della Segnatura è la prima stanza affrescata da Raffaello: era lo studio e la biblioteca di Giulio II.
il pontefice volle che si rappresentassero le tre grandi dimensioni della cultura di ogni tempo: il vero, il bello ed il buono.

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Sulla parete di ingresso sta la cosiddetta Scuola di Atene. la Scuola di Atene esalta la ricerca razionale. L'affresco, inquadrato da un arco dipinto, rappresenta i più celebri filosofi e matematici dell'antichità intenti nel dialogare tra loro, all'interno di un immaginario edificio classico, rappresentato in perfetta prospettiva. Il primo piano della Scuola di Atene ospita la figura di Eraclito.Sempre in primo piano, appare Pitagora, mentre legge un grosso libro e un altro personaggio gli regge una tavoletta.A sinistra di Platone si trova Socrate con una tunica verde bottiglia, indentificato per le somiglianze con i busti antichi che lo raffigurano.

A destra di Aristotele, con abiti contemporanei, Raffaello raffigura se stesso, vicino la colonna e altri personaggi del suo tempo. Riconosce loro il ruolo di intellettuali, ponendoli sullo stesso piano dei filosofi antichi e indicando l’unione e la continuità tra sapere antico e moderno.