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A coloração de Gram é uma técnica laboratorial fundamental utilizada para a identificação e classificação de bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo com as características da parede celular. Através da coloração diferencial, é possível observar a morfologia, o arranjo e a afinidade tintorial dos microrganismos, o que auxilia no diagnóstico clínico e em pesquisas microbiológicas.

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Confecção da lâmina – Passo a passo

1. Pegar uma lâmina de vidro limpa e seca.

2. Com uma caneta específica para lâmina, é feito um círculo no centro da parte inferior da lâmina (isso serve como referência para onde o esfregaço deve ser feito).

3. Utiliza-se uma alça de platina estéril para coletar a amostra (cultura bacteriana).

4. A amostra é espalhada em movimentos circulares dentro do círculo desenhado, formando o esfregaço bacteriano.

5. A lâmina foi deixada em repouso à temperatura ambiente até o esfregaço secar completamente.

6. Após a secagem, a lâmina é fixada passando rapidamente sobre a chama do bico de Bunsen por aproximadamente três vezes, com o esfregaço voltado para cima (essa etapa serve para fixar o material na lâmina, matando as bactérias e permitindo que elas adiram melhor ao vidro).

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1. Aplicar o cristal violeta (violeta de genciana)
Cobrir a lâmina com a solução de cristal violeta e deixar em contato com o esfregaço por 1 minuto. Esse corante é o corante primário e irá penetrar em todas as células bacterianas.

2. Aplicar a solução de Lugol (iodo)
Remover o excesso do cristal violeta com água corrente. Em seguida, cobrir a lâmina com a solução de Lugol e aguardar 1 minuto. O Lugol age como mordente, formando um complexo com o cristal violeta no interior das células.

3. Descorar com álcool-acetona
Aplicar rapidamente a solução de álcool-acetona por cerca de 15 segundos, promovendo a descoloração das bactérias Gram-negativas. Lavar imediatamente a lâmina com água corrente para interromper a ação do álcool.

4. Aplicar o contra-corante (Fucsina de Gram)
Cobrir a lâmina com a fucsina e deixar agir por 30 segundos. Esse corante irá corar as bactérias Gram-negativas de rosa, já que perderam a coloração roxa na etapa anterior.

5. Lavar e secar
Lavar a lâmina novamente em água corrente e secar delicadamente com papel absorvente (filtro), sem esfregar, apenas encostando o papel para retirar o excesso de água.

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Após a coloração estar completa e a lâmina devidamente seca, posiciona-se a lâmina no microscópio para observação em objetiva de imersão (100x). Adiciona-se uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço para melhorar a resolução da imagem.

Na leitura, observa-se a coloração e a morfologia das bactérias:

As bactérias Gram-positivas aparecem roxo-escuras, pois mantêm o corante cristal violeta mesmo após a descoloração.

As bactérias Gram-negativas aparecem rosa-avermelhadas, pois perdem o cristal violeta na etapa da descoloração e se coram apenas com a fucsina.

Além da coloração, avalia-se também a morfologia (forma) e o arranjo das bactérias, como cocos, bacilos, diplococos, estreptococos, entre outros.

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Sugerindo presença de Streptococcus pyogenes.

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Sugerindo Escherichia coli.

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Sugerindo Staphylococcus aureus.