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Detección de anomalías primarias clásicas por OGM

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Detección de anomalías primarias clásicas por OGM

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1. Translocaciones IGH:

Se identificaron en el 50% de los casos.

◦ t(11;14)(q13;q32): Positiva en 5 de los 10 casos.

◦ t(4;14): Identificada en dos casos (10%).

◦ t(6;14), t(14;16), t(14;20): Cada una se encontró en un solo caso.

◦ Por OGM se descubrieron dos translocaciones variantes que involucran al menos tres socios de translocación t(14;16;8;8) y t(11;14;19).

◦ El OGM demostró ser superior al análisis FISH estándar en la detección de translocaciones como t(6;14) en presencia de monosomía 14, donde el FISH podría dar una interpretación errónea al enmascarar la translocación.

2. Genomas hiperdiploides (HDM):

◦ Diez casos clasificados como HDM.

◦ Los casos HDM mostraron una prevalencia de ganancias en el cromosoma 15 (90%), seguido por el 9 (90%) y el 5 (80%).

◦ Los casos HDM con más de 3 translocaciones (5 casos) siempre mostraron pérdida del gen TP53 y anormalidades en la banda cromosómica 8q24.21, mientras que los casos con 0-3 translocaciones no tuvieron estas asociaciones.

3. Anormalidades del cromosoma 13:

◦ Se detectaron en 14 de los 20 casos (70%)

◦ 12 casos (60%) --> Pérdida del cromosoma 13.

◦ 2 casos (10%) --> Deleción dirigida.

◦ El OGM permitió identificar que genes como DLEU1 y DLEU2 estaban incluidos en la región delecionada, y RB1 en uno de los dos casos de deleción dirigida

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Análisis FISH

1. Choque hipotónico

2. Centrifugación (1200 rpm por 10 minutos), fijación con Carnoy y almacenamiento −20 °C.

3. Preparación de portaobjetos e hibridación con sondas FISH y se contrateñieron con DAPI

4. Hibridación de sondas FISH (hasta 5 por muestra)

Sonda para deleción de TP53 / centrómero del cromosoma 17

Sonda dual para IGH/FGFR3

Sonda dual para IGH/MAF

Sonda dual para IGH/MAFB

Sonda para amplificación/deleción CKS1B/CDKN2C (P18)

5. Análisis de núcleos (hasta 200 núcleos por sonda) → referencia para comparar con los datos de OGM

6. Confirmación de translocaciones y clasificación genómica

Las translocaciones t(11;14) detectadas por OGM → confirmadas con FISH con sonda dual IGH/CCND1

Muestra 12: no se pudo confirmar la translocación t(6;14) por FISH

Muestras 01, 30 y 33: evaluadas con sonda D5S23/D5S721/CEP9/CEP15 para confirmar la clasificación como HDM

Las muestras sin translocaciones IGH canónicas, pero con ganancias recurrentes de cromosomas impares detectadas por OGM, también fueron clasificadas como HDM.

Genomas no diploides (como triploides o tetraploides) se clasificaron como HDM si se observaron ganancias de cromosomas impares sin translocaciones IGH.

Se sospechó genoma no diploide si al menos 3 sondas FISH mostraban 3 o más señales por locus.

7. Confirmación de reordenamientos en 8q24.21/MYC

Se utilizó la sonda MYC breakapart o la sonda tricolor IGH-MYC-CEP8 para confirmar reordenamientos

Optical Genome Mapping

1. Extracción de ADN con Kit de generación 1 y 2

2. Procesamiento inicial y problemas técnicos

Problemas al correr OGM debido a la presencia de microesferas magnéticas en las muestras 01-07.

Las microesferas causaron obstrucción de chips y fallas en las corridas.

3. Incorporación del paso de eliminación de microesferas, el cual se basaba en el uso de un imán y la recolección del sobrenadante con ADN. El kit de generación 2 resultó ser más eficiente y ofreció mejores resultados.

4. Elución (en 55 μL) y preparación del ADN

5. Marcado y ejecución del OGM

Se usó entre 620 y 750 ng de ADN

Todas las muestras fueron corridas en el sistema Saphyr® (#G199, Bionano Genomics).

Se utilizaron chips de nano canales G2.3 (#20366) y G3.3 (#20440)

Análisis OGM (software Bionano Access v1.7.2.)

1. Análisis principal con RVA con el pipeline de análisis de variantes raras (RVA)

2. Criterios esperados de calidad para todas las muestras

Tasa de mapeo (map rate) esperada: mínimo 70%.

Cobertura efectiva (coverage): entre 300× y 400×.

Cantidad de datos genómicos (Gbp): al menos 1500 Gbp por muestra.

3. Análisis complementario para muestras no diploides

En muestras con sospecha de genomas no diploides (01, 12, 33 y 44) según FISH:

Se usó pipeline de análisis de novo adicional con ~250×

4. Configuración de filtros del RVA (análisis inicial) para eliminar variantes presentes en población normal

5. Verificación adicional para translocaciones IGH no detectadas

En muestras sin reordenamientos IGH detectados automáticamente:

Se ajustó la confianza a “All” para detectar translocaciones teloméricas como t(4;14) en muestras sin reordenamientos IGH automáticos.

6. Revisión de CNVs no detectados mediante el cambio del filtro de confianza para CNVs a “All”

7. Filtro específico con genes de cáncer para detectar alteraciones clínicamente relevantes en MM

8. Revisión visual del genoma para

detectar clones pequeños con aneuploidías o deleciones/ganancias debajo del umbral de detección automático.

9. Confirmación de translocaciones IGH

Las translocaciones del locus IGH fueron consideradas positivas si:

Estaban confirmadas por FISH.

El punto de ruptura (breakpoint) cerca de un oncogén relevante hasta ~1 Mb de distancia.

10. Clasificación de ganancia vs amplificación en 1q mediante el uso un valor de corte (cut-off) >3 en el fCN

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Límites asociados con los niveles de ploidía en OGM

OGM no detecta con precisión niveles de ploidía total (como triploidía o tetraploidía), ya que su análisis estándar (RVA) normaliza todos los genomas a un estado diploide (2n). Esto puede llevar a interpretaciones erróneas de pérdidas genéticas, especialmente en muestras no diploides, como en mieloma múltiple (MM), donde hay tetraploidía en algunos casos. Una alternativa es usar el análisis de novo, que permite identificar ploidías impares (como 3n) mediante variaciones en las proporciones alélicas, pero no detecta ploidías pares (como 4n). Además, este método requiere más recursos y tiempo (~24 horas por muestra).

Detección de la deleción de 17p/TP53

OGM detectó deleciones del gen TP53 en todas las muestras que fueron positivas por FISH. Cuatro de seis muestras fueron identificadas automáticamente por el software, y las otras dos mediante inspección visual. Al ajustar los filtros del software, se logró detectar una de las dos muestras restantes como deleción. Los valores de frecuencia alélica (VAF) obtenidos por OGM se correlacionaron bien con los porcentajes de células positivas por FISH, aunque con ligeras diferencias normales entre métodos. Las deleciones fueron grandes (7–22 Mb) y abarcaron amplias regiones del brazo 17p, no siendo pequeñas ni focales como en otras enfermedades.

Además, OGM mostró que estas deleciones fueron causadas por reordenamientos estructurales desequilibrados, frecuentemente translocaciones intercromosómicas, y se asociaron con un mayor número de SV y CNV en general. También se observó una frecuente co-ocurrencia de deleción en el brazo 8p. Sin embargo, en muestras con alteraciones en la ploidía, como la muestra 33, OGM puede generar falsos positivos, por lo que se recomienda una técnica de confirmación adicional. Se necesitan más estudios para mejorar la precisión de OGM en la detección de deleciones de TP53.

Anormalidades de 8q24.21/MYC

Se detectaron anomalías en la región 8q24.21 (locus MYC) en el 55% de las muestras (11 de 20). Nueve casos presentaron translocaciones complejas entre MYC e inmunoglobulinas (IGH, IGL) u otros genes, confirmadas por FISH en cinco muestras. En tres casos, FISH fue negativo debido a que las alteraciones eran pequeñas inserciones o inversiones que no separaban las señales. Además, dos muestras mostraron deleciones en lugar de translocaciones: una bialélica (por monosomía 8 y deleción focal del gen PVT1) y otra monoalélica que afectó a MYC y parcialmente a PVT1. Estas alteraciones del locus MYC están relacionadas con mal pronóstico en mieloma múltiple.

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Pacientes y características de la enfermedad

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Pacientes y características de la enfermedad

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De 45 pacientes, solo 20 tuvieron muestras adecuadas de BMA para realizar FISH y OGM, por lo que fueron incluidos. Entre ellos: 1 con mieloma indolente, 12 con mieloma recién diagnosticado, 6 recaídos o refractarios y 1 con leucemia de células plasmáticas secundaria. Se excluyeron 25 muestras: 19 por criterios de inclusión o muestreo, 5 por baja recuperación de CD138 y 1 por fallo en eliminación de microesferas.

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Métricas de la técnica OGM en células plasmáticas CD138+

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Métricas de la técnica OGM en células plasmáticas CD138+

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Se obtuvo suficiente cantidad de células CD138+ en las 20 muestras para extracción de ADN y análisis exitoso por OGM.

La adición del paso de eliminación de microesferas fue efectivo en la extracción de ADN

El kit de generación 2 es más eficiente que el dos

La muestra 45 no fue incluida en las métricas por no cumplir con los umbrales mínimos de datos, mapeo y cobertura. Sin embargo, se incluyó en el estudio por detectarse la translocación NSD2::IGH/t(4;14), confirmada por FISH. Solo se analizó esta translocación y una evaluación global de SV y CNV por OGM.

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El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia de células plasmáticas que se caracteriza por una alta morbilidad y es incurable en la mayoría de los casos. A medida que la enfermedad progresa, adquiere diversas alteraciones genéticas, que incluyen translocaciones, deleciones, duplicaciones, aneuploidías y mutaciones. Estas variaciones estructurales (SVs) son clave en el desarrollo y la génesis del MM. Existen dos tipos principales de anormalidades genéticas en la enfermedad: el mieloma hiperdiploide (con ganancias de cromosomas impares) y los genomas con translocaciones en el gen IGH, que causan sobreexpresión de oncogenes. Además, las anormalidades secundarias, como las deleciones en 1p32 y 17p13, y las ganancias de 1q21, también juegan un papel crucial en la progresión del MM.

El análisis citogenético, como la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), es el estándar para detectar estas alteraciones. Sin embargo, FISH presenta limitaciones, como la baja sensibilidad en ciertos casos y dificultades en la interpretación debido a la complejidad genética del MM. La secuenciación de próxima generación (NGS) ha permitido identificar variantes genéticas adicionales. Por otro lado, el mapeo genómico óptico (OGM) es una herramienta prometedora que podría superar estas limitaciones y proporcionar una visión más completa de la complejidad genética del MM. El objetivo de este estudio es evaluar el potencial del OGM para detectar aberraciones relevantes en MM y comparar su eficacia con la de FISH.

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El estudio se llevó a cabo con 43 pacientes con mieloma múltiple recién diagnosticado, en recaída o mieloma indolente, entre junio de 2021 y mayo de 2023. Se obtuvieron muestras de médula ósea (BMA) antes de la quimioterapia, que luego fueron procesadas mediante selección inmunomagnética de CD138 para purificar las células plasmáticas. Se estableció un umbral de al menos 2.5 millones de células plasmáticas recuperadas para su análisis. De los 43 pacientes, 18 cumplieron los criterios de inclusión, mientras que 25 fueron excluidos.

Las muestras de BMA fueron tratadas con estabilizador de ADN y las células plasmáticas fueron purificadas utilizando un kit de selección de CD138, seguido de un análisis de viabilidad celular. Una vez purificadas, las células plasmáticas se almacenaron a -80°C para la extracción de ADN y análisis genéticos posteriores. Además, se incluyeron muestras de dos pacientes con MM de un banco de células criopreservadas para asegurar la evaluación de las translocaciones IGH más frecuentes. Se utilizaron al menos un millón de células plasmáticas para el análisis de FISH y 1.5 millones para el análisis de OGM. El estudio evaluó las aberraciones genéticas mediante ambos métodos (FISH y OGM) para comparar su eficacia en la detección de alteraciones clave en el MM.

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Detección de deleciones 1p/CDKN2C: OGM detectó correctamente deleciones en 1p que afectan el gen CDKN2C en las muestras 02, 18 y 42, con validación por FISH.

Tamaño de las deleciones validadas: Las regiones que sufrieron deleciones en esas tres muestras oscilaron entre 12 y 73 Mbp.

Detecciones adicionales por OGM: OGM identificó supuestas deleciones en 1p en las muestras 33 y 44, con valores fCN de 1.37 y 1.72, respectivamente.

Interpretación de los resultados en muestras 33 y 44: FISH sugiere genomas no diploides en ambas muestras; probablemente hay tres copias del cromosoma 1, una con deleción o con ganancia desequilibrada de 1q.

FISH para CDKN2C: La muestra 33 mostró dos copias del gen en todas las células; la muestra 44, en el 43.9% de las células.

Tamaño de las deleciones en muestras 33 y 44: Las deleciones abarcan >100 Mbp, cubriendo casi todo el brazo corto 1p, a diferencia de las deleciones más focales en las muestras validadas.

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Sobre la variabilidad en los puntos de ruptura

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Sobre la variabilidad en los puntos de ruptura

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Los puntos de ruptura en IGH, t(11;14) y 8q24.21/MYC mostraron gran variabilidad entre pacientes.

En IGH, los puntos de ruptura se ubicaron en diferentes regiones (VDJ, constante y genes cercanos como PACS2).

En t(11;14), solo un caso afectó directamente a CCND1; otros ocurrieron en regiones vecinas.

En 8q24.21, las rupturas ocurrieron mayormente en PVT1 y no directamente en MYC.

Esta variabilidad puede afectar la expresión génica y el pronóstico del paciente.

OGM no detecta el punto exacto a nivel de par de bases, pero ofrece mejor resolución que FISH

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OGM es una técnica eficiente: El proceso completo (desde extracción hasta análisis) toma entre 5 a 7 días con poco tiempo manual.

Visión pangenómica: Ofrece una visión amplia del genoma de las células plasmáticas malignas, superando a FISH en resolución y contexto genómico.

Mejora en información pronóstica: OGM aportó datos pronósticos adicionales en el 30% de los casos (6 de 20 pacientes).

Limitaciones por ploidía: Las regiones TP53 (17p13.1) y CKS1B (1q21) pueden estar afectadas por la ploidía; en caso de duda se recomienda FISH.

Alta heterogeneidad en MM: Mismos eventos genéticos pueden asociarse a pronósticos distintos, lo que resalta la necesidad de herramientas más completas.

Necesidad de guías clínicas actualizadas: La integración de tecnologías como OGM requiere lineamientos clínicos renovados para una correcta interpretación y aplicación.