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Procedimento de coleta orofaringe:
Utilizar um abaixador de língua para pressionar gentilmente a língua;
Pressionar e rolar um swab estéril sobre as tonsilas e atrás da úvula, evitando tocar na língua, mucosa bucal e úvula; Tocar preferencialmente nas áreas com hiperemia e pontos de supuração;
Colocar o swab no meio de transpor e enviar ao laboratório;
Procedimento de coleta nasorofaringe:
Inserir o swab no orifícios nasal em paralelo com palato até a nasofaringe;
Fazer movimentos giratórios;
Colocar o swab no meio de transpor e enviar ao laboratório;

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Para coleta com swab, é necessário tomar alguns cuidados com o paciente, como manter a cabeça levemente inclinada para trás.

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CLED: Cistine lactose electrolyte deficient agar
Não seletivo: permite o crescimento da maioria dos microrganismos
Diferencial: indica a presença de fermentadores de lactose ou não. Colônias de bactérias que fermentam a lactose tornam o meio verde claro para amarelo, as que não são fermentadoras tornam o meio azul.

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MC: Ágar MacConkey
Seletivo: possui em sua composição cristal violeta e sais biliares que inibem o crescimento de bactérias Gram positivas, o que permite isolar os bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores)
Diferencial: indicar a presença de fermentadores de lactose ou não. Colônias de bactérias que fermentam a lactose tornam o meio rosa choque, as que não são fermentadoras tornam o meio amarelo claro.

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Ágar sangue: Meio não seletivo: permite o crescimento da maioria dos microrganismos
Diferencial: presença de halos de hemólise nítidos úteis para a diferenciação
de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp

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Interpretando todos os resultados das amostras um, dois e três, conseguimos concluir que a amostra 1 se trata Escherichia Coli, a amostra 2 se trata da Proteus mirabilis e a amostra 3 da Salmonella spp.

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Para o teste de voges-proskauer, quando positivo, conseguimos observar metade do tubo vermelho, como não conseguimos observar isso, todas as amostras deram negativo.

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Para o teste de vermelho de metila, todas as amostras deram positivas.

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No tubo 3 meio MIO, o primeiro teste a se observar foi a descarboxilação da ornitina, onde o resultado positivo é indicado pela coloração purpura e o negativo pela coloração amarela, as três amostras deram positivos.  O próximo teste foi o de motilidade, observamos turvação completa ou parcial do meio, as três amostras deram positivas, a próxima prova foi a do indol,  onde observamos um  anel cor de rosa no ápice do tubo, somente amostra 1 foi positiva, seguindo com o teste da ramnose, que possui uma cor amarela quando positivo, as amostras 1 e 3 deram positivo, o teste seguinte é teste do citrato, ele é positivo quando o meio fica azul ou então quando observamos crescimento na parte inclinada do tubo, amostra 2 e 3 deram positivas.

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No tubo 2, observamos o teste da descarboxilação da lisina, o tubo já possui uma coloração natural purpura, e se o resultado for positivo ele mantem a coloração e caso for negativo muda para amarelo, somente amostra 2 deu negativo e amostra 1 e 3 positivas.

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A ultima prova foi a hidrolise da ureia, onde observamos uma coloração azul na base ou fundo do tubo, somente amostra 2 deu positivo.

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A próxima prova foi a produção de H2S (sulfeto de hidrogênio), onde podemos observar o escurecimento do meio nas amostras 2 e 3.

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A terceira prova é a produção de gás CO2 a partir da glicose, podemos observar a presença de bolhas ou rachaduras, onde só foi possível observar na amostra 1 e 3.

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Na prova da fermentação da glicose observamos uma coloração amarelada no fundo do tubo, onde somente a amostra 1 deu positivo, entretanto não significa que o tubo 2 e 3 não estejam fermentando, mas a produção de H2S pode estar mascarando os resultados.

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Começamos a interpretação dos resultados pela amostra 1, em seguida o amostra 2 e assim por diante. Na primeira prova de desaminação de triptofano, o resultado positivo indica uma coloração verde garrafa no ápice na parte inclinada, então observamos que somente a amostra 2 era positivo.

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Antes de interpretar os resultados das amostras passadas, iniciamos a aula preparando o teste de voges-proskauer, transferindo 1 ml para o tubo vazio, em seguida transferimos 600 μL α-naftol e 200 μL de hidróxido de Potássio, agitamos levemente e aguardamos 15 minutos. Com o restante da amostra fizemos a prova do vermelho de metila, adicionamos 8 gotas do vermelho de metila e aguardamos. Também fizemos a prova do ágar fenilalanina, adicionando 200 μL de cloreto férrico de forma que o liquido caia sobre a parte inclinada na amostra do tubo, depois aguardamos. Partindo para o tubo MIO, colocamos 5 gotas do reagente de kovacs.

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Para identificação de enterobacteriaceae, no primeiro teste, usando agulha flambada encostamos na superfície de uma colônia e inoculamos o tubo 1 até o final e na volta estriamos a superfície, na hora de fechar o tube é necessário deixar a tampa um poco aberta para que haja contato com O2.  Como não estávamos utilizando colônias recentes é necessários coletar mais bactérias para inoculação dos demais tubos, no tubo 2 a inoculação foi feita por picada central ate o fundo e em seguida fechar, no tubo 3 foi feito da mesma forma tomando cuidado para que agulha faça o mesmo percurso de entrada para facilitar a prova de motalidade, no tubo 4, por ser liquido é preciso uma leve agitação no tubo para que a colônia se desprenda da agulha, também é preciso colocar 8 gotas de vaselina para formar um ambiente estéril, em seguida as amostras devem ir para estufa.

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Na amostra 3 de coprocultura, houve crescimento em macconkey sem fermentação de lactose. Já no meio salmonella shigella houve produção de H2S.

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Na amostra 2, houve crescimento em ambos macconkey e cled, sem fermentação de lactose e com contagem acima de 100 mil UFC por ml. Para poder diferenciar pseudomonas de enterobacteriaceae, é preciso fazer o teste de oxidase. Com auxilio da pipeta medimos 25 μL de solução salina e despejamos na tira reagente, em seguida coletamos um pouco das colônias para reagir com a solução salina, como o resultado se mostrou oxidase negativa, é necessário partir para os testes de identificação de enterobacteriaceae.

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Partindo para urocultura,  amostra 1 de macconkey e cled houve crescimento de bactéria com fermentação de lactose e glicose, indicando uma bactéria gram-negativo, confirmando uma Enterobacteriaceae. Como não foi possível realizar a contagem das colônias, podemos confirmar uma infecção urinaria acima de 100 mil UFC por ml.

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Iniciamos a aula observando o resultado do teste de sensibilidade a novobiocina, para então concluirmos a bactéria da amostra 2. Medimos o halo, e seu diâmetro foi de 25 mm, é considerado sensível um halo superior a 16 mm, então podemos finalizar a amostra 2 como Staphylococcus coagulase negativo.

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Amostras de urocultura e coprocultura.

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Para analise de coprocultura, existem três gêneros de bactérias mais comuns na infecção gastrointestinal, a salmonella, shigella e E-coli. Ágar salmonella shigella e macconkey são os mais  recomendado para trabalhar com esse tipo de amostra, por serem meios mais seletivos e as fezes serem muito ricas em bactérias. A semeadura de fezes, por ser uma amostra mista é feita por esgotamento.

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Para urocultura de mulheres gravidas é necessário acrescentar ágar sangue, para identificação do S. agalactiae, por ser uma bactéria beta hemolítica.

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O número de UFC é obtido através da contagem da alça de 1 μL. EX: Supondo que houve uma contagem de 100 colônias, multiplicamos esse valor por mil e obtivemos 100 mil UFC por ml.

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Lembrando que urina não é estéril, então se fizemos uma contagem de ate 10 mil UFC por ml, significa que é uma contaminação da microbiota, indicativo de infecção é quando a contagem ultrapassa 100 mil UFC por ml, e os resultados entre 10 e 100 mil são considerados duvidosos.

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Para trabalhar com as amostras de urocultura, os meios mais utilizados são o cled e mackonkey, é indicado também trabalhar com alça de 1 μL, porém, por falta de material utilizamos uma alça de 10 μL. Primeiramente homogeneizamos a amostra de urina antes de semear no meio seletivo e em seguida no meio não seletivo para que não haja contaminação entre os meios. Utilizamos técnicas de semeadura quantitativa para esse tipo de amostra.

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Com uma solução salina criamos uma suspenção de bactéria, onde pegamos uma quantidade de colônias na placa de ágar sangue e colocamos no tubo, levamos para o vórtex para homogeneizar a suspenção. Em seguida, em outra placa de ágar sangue, espalhamos a amostra de forma homogenia para que fiquem muito próximos umas das outras, e no meio dessa placa colocamos o antibiótico para observar se houve ou não formação do halo.

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Como a amostra 2 deu negativo para o teste de coagulase, seguimos para o teste de resistência a novobiocina.

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Iniciamos a aula pratica observando os resultados das amostras da semana passada, onde a amostra 1 para o teste de coagulase deu positivo, confirmando S. Aureus, e na amostra 2 deu negativo. O teste complementar de manitol confirmou S. Aureus, onde a amostra 1 ficou amarelado devido a fermentação do manitol.

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Logo após, realizamos a prova da coagulase, na amostra 2, retiramos cerca de quatro colônias e inserimos no tubo com plasma de coelho, atritando a alça na parede do tubo para que o inoculo possa se desprender. Também realizamos a prova complementar do manitol, de forma mais simples, apenas esfregando a alça em formato de zigue-zague na placa.

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Logo após a coloração, podemos observar as colônias no microscópio.

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Essa técnica consiste em depositar uma pequena alíquota do material em um ponto superior do meio da cultura, fazendo uma estria em zigue-zague até antes do meio da placa, sem recarregar a alça, deve-se fazer mais duas estrias, flambando sempre a alça entre uma e outra.

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Lembrando sempre que a estria não deve sobrepor a anterior mais do que duas vezes.

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Aula prática da disciplina de Microbiologia Clinica sobre técnicas de semeadura de microrganismos, foi realizada no dia 16/09/2022, por volta das 17 horas da tarde, no LDS.

Foram realizados procedimentos de Semeadura por esgotamento em meios de cultura previamente preparados nas aulas anteriores.

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Em seguida, iniciamos o teste de coloração de Gram, pegamos uma lâmina com salina para poder homogeneizar a colônia.
O método consiste no tratamento da bactéria com corante.  Primero, coramos com violeta por 60 segundos, em seguidas lavamos com esguicho de água destilada, cobrimos com Lugol por 60 segundos, novamente lavamos com esguicho de água destilada, depois lavamos com álcool por alguns segundos, em seguida lavamos com esguicho de água  e coramos por mais 60 segundos, e por fim, lavar, secar e observar no microscópio.

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Observando essas informações, temos dois grandes grupos que possuem características gram positivo e hemolítico, staphylococcus e streptococcus. Para fazer essa diferenciação, fizemos o teste de catalase, onde a formação de bolhas indica que o teste deu positivo.

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Com base nessas informações, entendemos que, pelo fato do macconkey ser seletivo para gram negativo, não ter crescido nenhuma colônia torna ele uma bactéria gram positiva, além de observamos um padrão hemolítico.

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Iniciamos a aula prática observando as características macroscópica das colônias, onde, observamos se houve ou não crescimento nas estrias que foram semeadas na aula anterior, pudemos observamos então, um crescimento moderado e abundante nas colônias, exceto pelo macconkey, que não houve crescimento das colônias.