# data[].attributes.body
peptide: 아미노산이 2개에서 50개 정도 결합된 짧은 폴리펩타이드 사슬이고 peptide만으로도 기능 수행 가능. (ex: insulin, Bac7)

protein: 보통 50개 이상의 아미노산으로 구성되어 수차례의 3차원 구조를 형성하여 기능 수행. (ex: hemoglobin, p53)

Xq peptide: X protein에 있는 기능과 관련된 부분으로 항암 효과를 발생시키는 X protein의 아미노산 구성 중 일부분.

# data[].attributes.headline
X 단백질은 항암 효과가 있다.

# data[].attributes.body
X 단백질은 항암 효과가 있다.

# data[].attributes.body
X 단백질이 발현된 E. coli에서 pilot-scale로 X 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다.

# data[].attributes.body
연구 내용인 '후보 항암 peptide/단백질의 pilot-scale 유용정제법 확립‘을 하기 위한 조건을 충족시키기 위해 설정함.

# data[].attributes.headline
가설 2에 필요한 가정

# data[].attributes.subject
가설 2에 필요한 가정

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가정 1

단백질 정제율은 약 10g/L 이다.

# data[].attributes.body
1. Metal Affinity Chromatography

2. BCA assay

3. Tandem Mass spectrometry

4. Pilot scale purification

# data[].attributes.headline
단백질 정제 크로마토그래피

# data[].attributes.subject
단백질 정제 크로마토그래피

# data[].attributes.body
1. ion exchange chromatography

단백질을 전하에 따라 분리.

양이온 교환 또는 음이온 교환 resin을 사용하며, 전하를 띤 단백질이 resin에 결합.

이후 염 농도를 점진적으로 높여 결합된 단백질을 순차적으로 용출.

2.  gel filtration chromatography

다공성 resin을 사용하여 분자의 크기에 따라 분리.

큰 분자는 resin의 기공에 들어가지 않고 바로 이동하므로 빠르게 용출되지만 작은 분자는 기공을 통과하면서 긴 경로를 거쳐 천천히 용출됨.

용출 시간에 따라 샘플을 분리.

# data[].attributes.headline
단백질 정제 크로마토그래피

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단백질 정제 크로마토그래피

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3.  affinity chromatography

단백질과 결합하는 특정 ligand를 사용하여 선택적으로 정제.

His-tag 단백질의 경우 금속 친화 resin을 사용하여 결합한 후, pH 조절 또는 경쟁 ligand를 첨가하여 단백질을 용출.

항원인 경우는 항원 특이적인 항체를 사용.

# data[].attributes.headline
금속 친화성 크로마토그래피 (Metal Affinity Chromatography)

# data[].attributes.subject
금속 친화성 크로마토그래피 (Metal Affinity Chromatography)

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니켈, 코발트 등의 금속을 활용해 정제하는 방법. 일반적인 친화 크로마토그래피와 유사하며 6x His-tag를 가진 단백질을 선택적으로 선별할 수 있음.

일반적으로 아가로스 등에 니켈(II)이 고정되어 있는 column을 사용.

Imidazole과 같은 킬레이트를 활용하여 His-tag와 금속 이온의 결합을 끊어내어 단백질을 최종적으로 추출하는 Elution과정을 수행함.

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친화성 크로마토그래피 정제 3단계

# data[].attributes.subject
친화성 크로마토그래피 정제 3단계

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1. Capture

2. Intermediate Purification

3. Polishing

# data[].attributes.body
목표 단백질에 Affinity가 있는 ligand를 사용해 목표 물질을 capture함.

Capture 단계의 가장 중요한 목적은 purity가 아닌 높은 회수율.

단백질이 단백질 분해 효소에 분해되지 않도록 빠른 시간에 농축해서 최대한 많은 단백질을 회수하는 것이 중요.

# data[].attributes.body
이 단계에서는 capture에서 잡힌 단백질인 목적 단백질과 대량의 불순물을 분리하면서 purity를 높이는 것에 목적을 가짐.

# data[].attributes.body
이 단계에서는 전 단계에서 모은 높은 purity의 목적 단백질을 한 번 더 최상의 purity로 갖기 위한 단계.

이는 단백질이 monomer, dimer, oligomer와 같이 여러 상태이거나 응집된 상태로 존재하기 때문.

단백질 의약품 제작일 경우 endotoxin을 제거해야 하고 구조 생물학 용도에서는 oligomer 상태를 제거한 후 monodispersed 상태만 선택해야함.

사용 또는 보관에 필요한 pH, 염 또는 첨가제를 최종적으로 조정해도 됨.

# data[].attributes.body
1. Ni-NTA

장점 : Acetyl기를 3개 가지고 있어 His-tag와 안정적으로 결합할 수 있으며 더 Hard한 조건에서도 안정적이고 높은 Purity를 보장할 수 있음.

단점 : IDA에 비해 가격이 더 높음.

# data[].attributes.body
2. Ni-IDA

장점 : Acetyl기가 두 개 존재하여 NTA보다 결합력이 약해 빠르게 용출이 가능.

단점 : 니켈이 느슨하게 결합하여 비특이적 결합이 발생해서 이로 인한 순도가 낮아짐.

=> 순도가 더 높은 것이 중요하다고 판단해 Ni-NTA로 선정.

# data[].attributes.body
HisPur™ Ni-NTA Resin

1ml 당 최대 60mg의 수율

10ml, 193,000원

His60 Ni Superflow Resin

1ml 당 최대 60mg의 수율

10ml, 213,600원

=> 수율 대 가성비 측면으로 봤을 때, HisPur™ Ni-NTA Resin 를 사용하는 것이 적절.

# data[].attributes.body
1. 단백질 샘플 준비

His-tag 단백질이 포함된 용액을 binding buffer와 희석시킴.

binding buffer는 일반적으로 pH 7-8 범위, 50mM Tris, 300mM NaCl을 사용.

샘플을 column에 흘려보내 His-tag 단백질이 결합하도록 함.

# data[].attributes.body
2. 세척

column에 남아있는 비특이적 결합을 제거하는 단계.

세척 버퍼에 낮은 농도의 imidazole(20-50mM)을 포함해 비특이적 결합 단백질만 제거.

이때 강한 환원제(DTT 등) 사용 시 니켈이 용출될 수 있으므로 주의.

3. 용출

고농도 imidazole(100-500mM)을 사용해 단백질과 니켈 간 결합을 경쟁적으로 방해.

His-tag 단백질이 column에서 떨어져 나와 회수됨.

# data[].attributes.body
BCA assay를 통해 단백질의 농도를 정확히 측정해서 MS 분석에 투입되는 샘플의 양을 조절해야 함. MS 분석은 투입된 단백질의 양에 따라 신호 강도가 달라지므로, 정확한 단백질 양을 투입해야 데이터를 재현 가능하게 얻을 수 있기 때문임.

=> BCA assay는 단백질 정제 후 샘플의 품질과 양을 확인하고 질량분석을 위한 샘플 준비를 최적화하는 데 매우 유용함.

반면, bradford는 실험 시간이 짧지만 정확성와 감도가 BCA에 비해 낮음.

# data[].attributes.body
BCA protein assay reagents 100ml (Pierce, 23227 : 203,000원)

단백질 sample

plate reader

# data[].attributes.body
1. 1ml의 BSA stock 용액 준비 (농도는 2mg/ml로 H2O에 녹임)

2. BSA 용액을 이용해 20-2000ug/ml 범위에서 8개의 희석 용액을 만들어 표준 곡선을 만듦.

3. BCA reagent A와 BCA reagent B를 50:1로 혼합해 working reagent(WR)를 만듦.

4. 20 well에 12개의 단백질 sample을 넣고 8개의 표준 용액을 10ul 씩 넣음.

# data[].attributes.body
5. 각 well에 200ul의 WR을 추가.

6. 37'C에서 30분 동안 반응시킴.

7. 실온에서 10분 동안 반응 후 측정 준비.

8. plate reader로 562nm에서 흡광도 측정.

9. 표준 곡선 방정식에 대입해 단백질의 농도 도출.

10. 농도 확인 후 Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)를 위해 시료 농도를 10ug/ul로 조정

# data[].attributes.body
샘플에 존재하는 하나 이상의 분자의 질량 대 전하 비율 ( m/z )을 측정하는데 유용함. (질량 스펙트럼 은 샘플에 존재하는 이온의 m/z 비율을 강도에 따라 표시한 것)

다음과 같은 목표를 위해 사용

1. 불순물이 잘 제거 되고 순도 높은 X단백질이 정제되었는지 확인.

2. X단백질이 실험 과정 중에 변성되지 않았는지 확인.

# data[].attributes.body
두 단계의 질량 분석을 통해 샘플을 분석하는 방법

첫 번째 단계에서 이온화된 전구체을 선택하고 두 번째 단계에서 이를 조각화하여 fragment 이온을 생성함.

이 fragment 이온을 분석함으로써 단백질 서열이나 화합물 구조에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있음. 즉, 목적 단백질에 대한 정보를 얻음.

반면, 일반 MS는 한 번의 질량 분석만 수행하여 샘플의 전체 질량 정보를 제공하는데 이것은 정확한 서열 정보를 얻기 어려움.

# data[].attributes.body
샘플을 ESI(Electrospray ionization)로 이온화 하고 첫 번째 질량 분석 진행.

CID(Collision-Induced Dissociation)를 통해 이온화된 단백질을 이온화된 peptide로 분해.

두 번째 질량 분석을 이온화된 peptide로 진행.

질량 대 전하 비율 스펙트럼 분석.

# data[].attributes.body
ESI(Electrospray ionization): 액체에 고전압을 가하여 작은 방울을 생성함으로써 질량 분석용 이온을 생성하는 기술

1. 고전압을 가하면 액체가 전기적으로 분해됨.

2. 고전압의 영향으로 액체는 작은 방울들로 분해되며, 이 작은 방울들이 공기 중으로 퍼지면서 미세한 액체 방울들을 형성.

3. 이 작은 방울들이 공기 중에서 더 작은 크기로 증발하면서 남은 물질들이 이온화됨.

즉, 샘플에 있는 분자들이 전하를 가지게 됨.

# data[].attributes.headline
삼중 사중극자 질량 분석기

# data[].attributes.subject
삼중 사중극자 질량 분석기

# data[].attributes.body
1. 1차 질량 분석 (Q1)

샘플이 이온화되어 질량 분석기로 들어오면 Q1에서 이온들이 질량 대 전하 비율에 따라 분리됨.

2. 충돌 및 분해 (Q2)

Q1의 이온은 Q2로 이동합니다. 이곳에서 이온에 충돌 가스(아르곤)를 충돌시켜 충돌 이온화(CID, Collision-Induced Dissociation)를 발생 시킴.

이 충돌로 인해 전구체 이온은 분해되어 fragment 이온을 생성하게 됨.

# data[].attributes.headline
삼중 사중극자 질량 분석기

# data[].attributes.subject
삼중 사중극자 질량 분석기

# data[].attributes.body
3. 2차 질량 분석 (Q3)

Q2에서 생성된 fragment ion은 Q3로 이동.

여기서 Q3는 fragment 이온들의 질량 대 전하 비율을 다시 한 번 분석. 이를 통해 원래의 화합물 또는 단백질의 정보를 얻을 수 있음.

# data[].attributes.body
질량 분석 스펙트럼을 얻음. 피크 사이의 질량 대 전하 비율을 차이를 이용해 아미노산 잔기 식별 가능.

단백질의 주요 피크 확인: 정제된 단백질이 반복된 피크로 나타나면 X단백질의 서열임을 알 수 있음. 다양한 불순물이 섞여 있으면 추가적인 불규칙적 피크들이 나타날 수 있음.

분자량 비교: 정제된 단백질의 분자량이 X단백질 분자량 값과 일치하는지 확인. 예상 분자량과 일치하지 않으면 실험 과정에서 정제가 제대로 되지 않았거나 단백질이 분해되었을 가능성이 있음.

# data[].attributes.body
새로운 생산 기술을 채택하고 실험실 규모의 정제 및 생산 방법을 실제 대량생산에서 가능한지 확인하는 단계.

생산 비용을 분석하고 경제적으로 적합한지 확인하는 단계. 다만 동시에 연구의 목적도 가지고 있기에 어느 정도의 경제성의 희생이 있을 수 있음.

이 과정에서 품질과 수율이 일정하게 유지되는 것을 목표로 함.

# data[].attributes.body
pilot scale에 적합한 30L 발효조에서 E. coli를 배양한다.

온도 : 37°C

공기 공급 속도 : 1 vvm

pH : 7.0

배양시간 : 36시간

1. 20L의 배지를 발효조에 넣는다.

2. 121 ºC, 1.5기압으로 15분간 멸균한다.

사용되는 배지 : 500L , 3,000,000원 (formedium)

# data[].attributes.body
초음파를 이용한 cell lysis

장점 : 빠른 속도로 세포를 용해시킬 수 있음. 다양한 세포를 효율적으로 용해시킬 수 있음. 비화학적인 방법으로 세포를 용해시킬 수 있음.

단점 : 초음파를 이용할 때 열이 발생하여 단백질이 변성될 수 있어 적절한 냉각법이 필요. 대용량의 시료에는 부적합.

# data[].attributes.body
고압 균질기

장점 : 대량 처리 가능, 박테리아, 효모 등을 효과적으로 용해, 냉각 시스템을 통한 열 발생을 억제.

단점 : 초기 비용 및 유지 보수의 문제, 소량 처리에는 비효율.

# data[].attributes.body
Pilot scale에서 수행한다는 것을 고려할 때, 대량 처리를 할 수 있는 고압 균질기를 사용하는 것이 적합.

# data[].attributes.body
APV Rannie

Pilot scale에 적합한 고압균질기로 최대 1000 bar에서 시간당 80 liter 처리가 가능함.

# data[].attributes.body
1. 샘플 준비: 세포를 적절한 완충 용액(예: PBS, Tris-HCl)에 재현탁. 보통 세포 농도는 10-50%로 설정.

2. 압력 설정: 초기: 10,000 psi (처음에 낮은 압력으로 시작). 최적화: 20,000~30,000 psi로 반복 처리.

3. 반복 처리: 세포가 완전히 용해될 때까지 1~3회의 균질화 과정 수행.

4. 온도 제어: 냉각 재킷 또는 얼음으로 샘플 과열 방지.

5. 원심분리: 용해된 샘플을 원심분리하여 세포 파편 제거 후 상등액에서 단백질/핵산 회수.

# data[].attributes.headline
단백질 정제 기기 선정

# data[].attributes.subject
단백질 정제 기기 선정

# data[].attributes.body
기기 선정 기준

1) Pilot scale을 수행할 수 있는 용량

2) 금속 친화 크로마토그래피를 할 수 있어야 함.

위 내용에 근거했을 때 AKTA 사의 AKTA Process 기기를 사용하는 것으로 결정함.

# data[].attributes.body
사용되는 resin : 500ml, 5,166,000원

-> 20L의 배지에서 배양하면 대략 200g의 단백질이 생성됨. resin은 1ml 당 60mg의 단백질을 잡을 수 있기에 약 350ml의 resin이 필요해서 여유있게 500ml의 resin을 구매.

resin의 경우 세척한 후 계속 재사용이 가능해 다시 구매할 필요는 없음.

# data[].attributes.body
Binding Buffer

sample loading 전, 다른 단백질의 비특이적 결합을 막기 위해 넣는 버퍼.

소량의 imidazole을 넣어 결합력이 약한 다른 불순물이 붙는 것을 방지.

washing Buffer

마찬가지로 비특이적인 결합을 제거하기 위해서 넣는 Buffer임.

조금 더 진한 imidazole을 넣어 불순물을 제거.

Elution Buffer

His-tag와 NTA를 분리하기 위해 사용하는 Buffer. 고농도의 imidazole을 사용.

# data[].attributes.body
이 표를 기준으로 500L의 배지를 정제 시 필요한 양

Tris pH 7.5: 50 kg, 4,950,000원 (덕산종합과학)

NaCl: 1300 kg, 3,603,600원 (덕산종합과학)

Imidazole: 142.5 kg, 5,349,960원 (덕산종합과학)

Glycerol: 200 L, 1,540,000원 (덕산종합과학)

β-mercaptoethanol: 7.5 kg, 299,200원 (덕산종합과학)

# data[].attributes.body
1) 컬럼 준비 및 연결

목적 :

컬럼에 사용할 레진을 넣어 결합시키는 단계

설정 :

HisPur™ Ni-NTA Resin 400ml를 컬럼에 넣음.

# data[].attributes.body
단백질이 합성된 후 거치는 여러 화학적인 변형 과정을 통칭함.

식물에서 단백질 발현 시 발생하지만 E .coli에서는 거의 발생하지 않음.

Phosphorylation, Glycosylation, Acetylation, Methylation 등이 포함.

# data[].attributes.body
2) 컬럼 평형화 (Equilibration)

목적:

컬럼을 결합 버퍼로 평형화하여 단백질 결합 준비.

용매가 컬럼을 빠르게 통과할 때 발열 효과로 인해 컬럼이 손상되는 것을 방지.

설정:

버퍼: Binding Buffer

볼륨: 5 컬럼 볼륨(CV)

UV 값 안정화 확인.

# data[].attributes.body
X 단백질을 대량 발현하는 E. coli를 제작 가능하다.

# data[].attributes.body
연구 내용인 '후보 항암 peptide/단백질의 효과적인 대량 발현을 위한 시스템 개발' 을 하기 위한 조건을 충족시키기 위해 설정함.

# data[].attributes.headline
가설 1에 필요한 가정

# data[].attributes.subject
가설 1에 필요한 가정

# data[].attributes.body
가정 1

선행 연구에서 식물이 발현한 X 단백질에서 PTM에 의한 modification이 확인되지 않았다.

가정 2

E. coli 배양 과정에서 심각한 mutation이 발생하지 않는다.

# data[].attributes.body
1. LB 배지 만들기

2. Heat Shock

3. Cell Culture

4. Cell lysis

5. Salting out

6. Sandwich ELISA

# data[].attributes.body
BL21 계열: 단백질 발현을 위한 E.coli 균주로 높은 수준의 단백질 또는 peptide 발현을 위해 사용함. T7 RNA polymerase를 발현하기 때문에 T7 promoter를 사용하는 시스템 하에서 고수준 발현하고 단백질 발현에 필요한 protease가 결여되어 있어서 단백질 안정성이 높음.

DH5a: 유전자 클로닝 및 플라스미드 증식에 최적화된 균주로 배양이 쉽고 빠르지만 단백질 발현에는 적합하지 않음.

=> BL21 선정

# data[].attributes.body
BL21(DE3): 상대적으로 간단하고 표준적인 재조합 단백질 발현 시스템으로 유전자 발현이 T7 시스템에 의해 조절되기 때문에 발현이 빠르고 효율적입니다. 특별한 조건이 없다면 BL21(DE3)사용이 적합.

BL21(DE3) pLysS: 발현하려는 단백질이 독성이 강한 경우, T7 lysozyme에 의해 T7 RNA polymerase의 과발현을 억제하여 독성 발현을 조절할 수 있음. 발현하려는 단백질이 독성이 강한 경우 적합.

BL21 star(DE3): BL21(DE3)와 유사해서 T7 RNA polymerase 발현과 유전자 발현 효율성은 유지하면서, RNA 유전자 mutation이 있어 세포 내 RNase E 활성을 억제하고 이는 mRNA 분해를 줄여 mRNA 안정성을 높이고 결과적으로 단백질 발현량을 증가시킴.

# data[].attributes.body
단백질의 안정적인 대량 발현이 중요하다고 판단.

=> BL21 Star(DE3)가 RNA 유전자 mutation이 있어 세포 내 RNase E 활성을 억제하고 이는 mRNA 분해를 줄여 mRNA 안정성을 높이고 결과적으로 단백질 발현량을 증가시키기 때문에 가장 적합해 BL21 Star(DE3)로 최종 선정.

# data[].attributes.body
x/pDaval plasmid의 PT5도 T7 RNA polymerase에 인식되어 전사 유도가 가능하지만 T7 promoter는 T7 RNA polymerase와 결합할 때 높은 수준의 단백질 발현을 유도하기에 따로 plasmid 제작함.

# data[].attributes.body
강력한 발현 수준
T7 promoter는 매우 강력한 promter로 T7 RNA polymerase와 결합할 때 높은 수준의 단백질 발현을 유도. 이는 대량 발현이 필요한 실험에서 유리.

특이성
T7 RNA polymerase는 T7 promoter에만 특이적으로 결합하므로 목표 단백질만 선택적으로 발현시킬 수 있음.

# data[].attributes.body
빠른 전사 속도
T7 RNA polymerase는 T5 promoter에 의존하는 전사보다 더 빠르게 RNA를 합성할 수 있어 단백질 생산 속도가 더 빠름.

비표적 단백질 발현 감소
T7 promoter는 일반적으로 세포 내에서 비활성 상태로 유지되다가 T7 RNA polymerase가 제공될 때만 활성화. 이는 비표적 단백질의 발현을 줄이는 데 도움이 됨.

# data[].attributes.body
Heat shock: 열 충격을 통해 세포막을 일시적으로 투과성으로 만들어 외부 DNA가 세포 내로 들어갈 수 있도록 하는 방식. 주로 박테리아에 사용하고 비교적 간단해 큰 숙련도를 요구하지 않으며 세포 생존률이 높음.

Electroporation: 전기 충격을 이용해 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시키는 방식. 구매 비용 높고 고전압이 가해질 때 세포가 과도한 스트레스를 받아 세포 손상이 발생할 수 있음.

# data[].attributes.body
Bacto-tryptone 5g (Thermofisher 500g, 180,000원)

Yeast extract 2.5g (생물나라 100g, 33,000원)

NaCl 5g (덕산종합과학 500g, 4,950원)

dH2O 500mL (바이오니아 500ml, 15,000원)

1. 재료들을 1L pyrex 병에 넣음.

2. 마그네틱 바와 교반기를 이용해 배지를 녹여줌.

3. autoclave를 이용해 121'C에서 15분 동안 멸균함.

# data[].attributes.body
competent cells (BL21 Star (DE3)) 50ul (thermofisher 100ul 16,000원)

LB media 500ul

LB plates with proper antibiotics (AMP 포함) (생물나라 5,500원)

제작 Plasmid (vectorbuilder 200,000원)

# data[].attributes.body
1. -80°C에서 competent cell을 꺼내 얼음 위에 20분 동안 보관.

2. 1.5ml tube에 녹인 competent cell 50ul에 plasmid 10ng를 추가하고 pipetting. (변형 효율을 저하시키므로 vortexing하지 말 것)

3. 반응 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양.

4. 반응 혼합물을 water bath 42°C에서 30초 동안 놓아 세포에 열 충격을 가함.

5. 열 충격 후 세포를 얼음 위에 2분간 incubation.

# data[].attributes.body
6. LB 500uL를 추가.

7. 튜브를 37°C의 shaker(180rpm)에 1시간 동안 둠.

8. incubation 후 4000rpm에서 2분 동안 centrifuge 후 상층액 400ul를 따라냅니다. pellet을 남은 상등액과 혼합.

9. 혼합물을 10uL과 90uL로 나누어 적절한 LB agar plate에 퍼뜨림.

10. plate를 밤새 37°C에서 배양.

11. 배양 12~16시간 후, plate에서 colony가 생성.

# data[].attributes.body
plate에 colony가 생성되면 E. coli가 ampicillin 저항성이 있다는 것임

형질전환이 잘 진행이 되었다는 증거

# data[].attributes.body
추후에 진행할 ELISA를 위해 전 실험에서 얻은 colony를 액체 LB 배지에 배양한다.

액체 LB 배지는 plate 배양보다 대량 배양, 균일한 세균 분포, 후속 실험에 사용하기 편함 등의 장점이 있음.

# data[].attributes.body
ampicillin (kisanbio 5g, 29,000원)

IPTG (바이오니아 1g, 26,000원)

IPTG 사용하는 이유: LacI는 lac 오페론의 promoter에 결합해 유전자의 발현을 억제. IPTG가 LacI에 결합하면 LacI가 promoter에서 떨어져 RNA polymerase가 유전자 전사를 시작해 결과적으로 promoter down stream의 목표 유전자가 발현됨.

# data[].attributes.body
1. 재료들을 1L pyrex 병에 넣음.

2. 마그네틱 바와 교반기를 이용해 배지를 녹여줌.

3. autoclave를 이용해 121'C에서 15분 동안 멸균함.

4. 배지를 약 50'C 이하로 식혀준 후 ampicillin 50mg을 넣어줌.

5. pipet을 사용해 20ml 씩 분주해서 20개의 배지를 만듦.

6. 소독된 도말 루프로 배양된 colony의 일부를 긁어서 루프에 붙임.

7. 루프를 배지에 넣고 흔듦.

8. 37'C에서 3시간 동안 배양

9. 각각의 배지에 IPTG 4.766mg을 넣음 (최종 농도 0.5 mM)

10. 37'C에서 24시간 동안 배양.

# data[].attributes.body
1. 10ml의 E. coli 배양액을 50ml tube에 옮김.

2. 8000 rpm에서 3분간 centrifuge.

3. pellet이 만들어지면 -80'C에서 1시간 보관.

4. pellet을 NPI-10 buffer (1L, 140,000원) 40ml에 재현탁.

5. 세포 현탁액을 ice bath에 보관해 tube가 단단히 고정되게 함.

6. Sonic probe를 세포 현탁액에 잠기게 함.

7. Sonic probe를 60kHz로 설정하고 30초간 작동 후, 1분간 냉각.

8. 이 과정을 5번 반복해 lysis함.

9. lysis 후, 세포 잔해를 12000rpm, 4'C에서 20분 centrifuge.

10. 상층액을 새로운 tube로 옮김.

(상층액에는 단백질과 기타 용해 물질이 남음.)

# data[].attributes.body
Salting out(Ammonium sulfate precipitation)은 비교적 시간이 오래 걸리지만, 단백질 변성이 발생할 가능성이 낮아 선택.

반면, TCA 침전법은 단백질 변성 위험이 높음.

# data[].attributes.body
Ammonium sulfate와 같은 고전하 이온이 물 분자와 결합하면서 단백질 표면에서 물 분자를 제거됨.

=> 단백질의 소수성 부분이 노출되어 단백질끼리 상호작용이 증가해 용해도가 감소하여 단백질의 침전이 유도됨.

# data[].attributes.body
Ammonium sulfate (덕산종합과학, 500g 5,830원)

1 M Tris-HCl, pH 7.5 (바이오니아, 500ml 29,000원)

1 X PBS , pH 7.2-7.4 (바이오니아, 500ml 26,000원)

Tube

# data[].attributes.body
1. 단백질 용액을 150mL 준비.

2. 1M Tris-HCl, pH 7.5를 최종 농도 50mM에 첨가.

3. 부드럽게 저어주면서 황산암모늄을 45% 포화 상태(277g ammonium sulfate/L)까지 천천히 첨가.

4. 4℃에서 10시간 동안 교반.

5. 침전 용액을 50mL 원심분리기 병에 옮김.

# data[].attributes.body
6. 25,000 xg에서 4 ºC에서 20분 동안 centrifuge하여 침전된 단백질을 pellet화함.

7. 상등액을 제거함 (pellet이 남음).

8. pellet을 PBS, pH 7.2에 재현탁함. (용액은 탁한 상태로 유지되지만 눈에 띄는 응집체는 보이지 않음).

9. 잔류 침전물 제거를 위해 25mL 튜브로 4 º에서 25,000 xg에서 10 분 동안 centrifuge함.

10. 8,9번을 한 번 더 반복해 ammonium sulfate를 washing함.

# data[].attributes.body
X 단백질 발현량이 높은 E. coli clone을 선별하기 위해 ELISA를 이용해 단백질 발현량을 측정함.

indirect, sandwich, competitive ELISA 중 sample에서 항원의 존재를 확인하는데 좋은 sandwich ELISA 사용 (capture Ab와 Detection Ab를 통해 더 특이적인 detection 가능)

# data[].attributes.body
Positive control: SS바이오의 순수 X 단백질 샘플

=> ELISA가 X 단백질에 대해 특이적으로 작동하는지, 항체가 제대로 결합하는지 확인하기 위해 사용. (강한 신호가 발생)

Negative control: X gene으로 형질전환되지 않은 BL21 Star(DE3) 샘플

=> 비특이적 결합이나 백그라운드 신호를 확인하기 위해 사용

실험군: X gene으로 형질전환된 BL21 Star(DE3) colony 20개

# data[].attributes.body
ELISA coating buffer 1X (abcam, 120ml 73,500원)

capture Ab (고마바이오텍, mouse monoclonal Ab 주문 제작)

96 well microplate (abcam, 220,000원)

25X wash buffer (thermofisher, 100ml 113,000원)

blocker BSA (thermofisher, 200ml 252,000원)

protein sample

Unconjugated detection antibody (고마바이오텍, mouse monoclonal Ab 주문 제작)

Conjugated secondary antibody (sigma, Goat Anti-Mouse IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate, 373520원)

TMB solution (gendepot, 100ml 67,300원)

0.2N H2SO4 (덕산종합과학, 500ml 6,600원)

# data[].attributes.body
1. capture Ab를 coating buffer에 1ug/ml로 희석.

2. Ab 용액 50ul을 well에 첨가하고 clear plate를 덮은 후 실온에서 2시간 동안 흔들어서 well에 흡착.

3. well을 wash buffer로 3번 씻음.

4. 각 well에 blocking buffer 200ul 첨가하고 실온에서 1-2시간 흔들어줌.

5. sample 100ul을 well에 넣고 실온에서 2시간 흔들어서 흡착.

6. well을 wash buffer로 3번 씻음.

=> plate가 capture Ab와 sample로 코팅되었으므로 detection Ab로 검출하는 단계를 진행.

# data[].attributes.body
7. Ab를 blocking buffer로 희석.

8. detection Ab 100ul을 각 well에 넣고 플레이트를 덮고 실온에서 2시간 배양 후 well을 wash buffer로 3번 씻음.

9. 2차 Ab 100ul을 각 well에 첨가 후 실온에서 1-2시간 배양 후 well 을 wash buffer로 씻음.

10. 각 well에 효소 기질 용액(TMB) 50ul을 넣고 plate를 교반하면서 배양.

11. 각 well에 정지 용액(0.2N H2SO4) 100ul 첨가 후 1분간 섞어줌.

12. plate reader로 450nm에서 결과 확인.

# data[].attributes.body
OD 값 확인

ELISA 결과에서 각 well의 OD 값이 높을수록 X 단백질의 발현량이 많음.

20개 배지 중에서 가장 높은 OD 값을 보인 배지를 선택.

가설 2 실험에 선택된 배지를 사용

# data[].attributes.body
3) 샘플 로딩 (Sample Loading)

목적

His-tag 단백질이 포함된 샘플을 컬럼에 주입하여 니켈과 결합시키는 단계

설정:

샘플: 0.22μm 필터 사용

유속은 1mL/min로 설정

실시간 UV 280nm 데이터를 확인해 결합 완료 상태 점검.

# data[].attributes.body
https://en-cdn.bio-protocol.org/pdf/bio-protocol44.pdf

https://www.abcam.com/en-us/technical-resources/protocols/sandwich-elisa?srsltid=AfmBOorxIfc_xh4-7MVuiy2oNqMrpFOrdKVsCqWzUB9QBxMCi9gr5T'SA

https://www.nature.com/articles/s43586-022-00175-x

https://www.vectorbuilder.kr/design.html

https://sharebiology.com/heat-shock-transformation-e-coli-protocol/

https://www.researchgate.net/publication/357184157_Comparative_Evaluation_of_Heat_Shock_and_Electroporation_Transformation_of_Canine_Homlogue_of_HER2_Gene_Cloned_in_a_PUC57_Plasmid_Construct

https://www.biozoa.co.kr/goods/view?no=570

https://www.labmall.co.kr/shop/item.php?it_id=c016130067THE

https://cnkosun.en.made-in-china.com/product/tocQkFhKlyTO/China-30L-50L-100L-Stainless-Steel-Food-Grade-Laboratory-Bio-Fermenter.html

https://scienceon.kisti.re.kr/commons/util/originalView.do?cn=JAKO201506838217757&oCn=JAKO201506838217757&dbt=JAKO&journal=NJOU00422414

https://www.santaisci.com/ko/faqs/why-do-we-need-to-equilibrate-the-column-before-separation/https://www.ibric.org/bric/community/qna.do?mode=view&articleNo=9788744&title=His+tag+column+%EC%9E%AC%EC%82%AC%EC%9A%A9+%EB%AC%B8%EC%A0%9C

# data[].attributes.attachment_link.readable_text
The heat shock method is one of the most used methods for transforming E.coli with the plasmid of interest.

Applications

Propagation of plasmid DNA

Storage of plasmid DNA (in the form of glycerol stock)

Synthesis of proteins

To modify the metabolism of bacterial

Reagents

Instruments and other requirements

Incubator shaker.

Incubator.

Water bath or heat block.

Laminar flow hood.

Centrifuge.

Pipettes.

Sterile tips.

Spreader, and parafilm.

Keep Following ready before starting the transformation

1. Make sure laminar flow is available at the time of spreading (about 1.5-2 hr from the beginning of protocol).

2. Make sure the incubator is available for the entire duration of the experiment and is set for 37°C.

3. Keep the LB agar plates (with appropriate antibiotic) and media (or appropriate media) at room temperature or 37°C.

4. Water bath or heat block at 42°C.

Duration of the experiment

the experiment takes nearly 2 hours to complete the transformation, 12-16 hours after transformation (spreading)for the colonies to appear on the plate.

Procedure

1. Take out the competent cells from -80◦C and keep them on ice for 5-10 mins.

2. Add the ligation mix or plasmid to the competent cells and mix gently. Do not shake or vortex as it will inhibit transformation efficiency.

3. Incubate the reaction mix on ice for 10-15 minutes.

4. Give a heat shock to the cells by placing the reaction mix at 42°C for 30-90 seconds (water bath or Heat-block).

5. After the heat shock, transfer the cells onto the ice and add 500uL of warm LB

6. Place the tubes in the shaker (180 rpm) at 37°C for 1 hour.

7. After the incubation, give a brief spin at 4000 rpm for 2-3 minutes and decant the supernatant of 400 ul. Mix the pellet with the remaining supernatant (~100uL)

8. Split the mixture into 10uL and 90uL to spread onto different plates with appropriate antibiotics (or auxotrophic selection).

9. Incubate the plates overnight at 37°C.

10. After 12-16 hours of plating, colonies can be observed on the plates.

Variations of the protocol
Step 5:
Adding 250 ul of media to the heat-shocked cells eliminates the spinning step, and one can directly spread the 10 % and 90 % volume on selective plates after 1-hour incubation.

The plating of two different volumes helps in selecting well-spaced individual colonies for the downstream process.

Storage

The agar plates with bacterial colonies can be stored for a week @4°C. However, plates that contain antibiotics with less shelf-life may not be stored as without selection pressure, satellite colonies grow.

Caution

Do not leave the plates for more than the recommended time on incubator as overgrowth of colonies makes it challenging to pick individual ones, and it might produce satellite colonies (without plasmid).

# data[].attributes.attachment_link.title
Heat shock transformation (E.coli) protocol - Sharebiology

# data[].attributes.attachment_link.description
Heat shock transformation is the most used method of incorporating recombinant vectors into E.coli. In this article, the protocol for transformation is given in detail.

# data[].attributes.body
가설 1

X 단백질을 대량 발현하는 E. coli를 제작 가능하다.

가설 2

X 단백질이 발현된 E. coli에서 pilot-scale로 X 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다.

# data[].attributes.body
4) 세척 (Washing)

목적

비특이적으로 결합한 불순물 단백질을 제거하는 단계

설정:

버퍼: Washing Buffer (20mM imidazole).

볼륨: 10 CV

# data[].attributes.body
2,072,200원

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23,908,760원

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5) 용출 (Elution)

목적

결합된 His-tag 단백질을 컬럼에서 용출.

설정:

버퍼: Elution Buffer (250~500mM imidazole).

볼륨: 5 CV (또는 UV 피크를 확인하며 조정).