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¿De qué manera influye la contaminación microbiana en los procesos de propagación y micropropagación de semillas de frutales?

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Identificar la influencia de la contaminación microbiana en los procesos de propagación y micropropagación de semillas de frutales.

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Contaminación microbiana y oxidación fenólica en la micropropagación de especies frutales.
Se presenta por malas prácticas al momento realizar los procesos en el laboratorio, explantes demasiado grandes que se convierten en hospederos de de residuos como polvo y algunos hongos que se ubican entre yemas apicales.

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Propagación y Micropropagación de Plantas

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Propagación y Micropropagación de Plantas

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Problemas de contaminación microbiana en los procesos de propagación y micropropagación de semillas

Presentado por:
Edwin Giovanny Moreno – Cód. 11365342
Angel Adrian Bejarano - Cód. 1003684688
Gilber Alexander Ladino - Cód. 1022424096
Juanita Andrea Maldonado - Cód. 1000708269

Grupo colaborativo 30161_32

Presentado a:

Oscar Eduardo Valbuena
Director de curso.

Universidad Nacional Abierta y a Distancia Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente

2023

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Los materiales que se van a utilizar son con los que cuenta el laboratorio de sanidad vegetal (el cual está abierto a los agricultores, estudiantes y público en general, a nivel regional y nacional, UNAL, 2022) y estos son: autoclave, incubadora, microscopio, cabina de flujo, horno, agitador, medios de cultivo agar nutritivo y PDA, cajas de Petri, asa bacteriológica, alcohol, hipoclorito y agua destilada.

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Localización: El montaje del ensayo en campo se realizará en una finca/vivero comercializador de semillas en Cundinamarca, ubicada en el municipio de Gama.
En las pruebas de germinación se establecen las siguientes condiciones: Se pondrán las semillas, previamente desinfectadas en una caja Petri estéril con su respectivo papel filtro, para luego ser humedecidos con agua destilada estéril, permitiendo la posibilidad de evidenciar patógenos en la semilla y el crecimiento del mismo en el papel.

Evaluación de incidencia y severidad: Las evaluaciones de la presencia y del avance de los síntomas se realizarán dos veces por semana. La evaluación de la severidad se realizará usando la escala diagramática cuantitativa desarrollada para la evaluación de los síntomas identificados con el fin de establecer el grado de severidad de la enfermedad. La incidencia se calculará como el número de semillas con presencia de síntomas sobre el total de semillas evaluadas por cien.

Obtención de aislamiento bacterianos puros: Las semillas se seleccionarán de forma aleatoria para la realización de pruebas y tratamientos, como en el proceso de desinfección de la muestra (semilla) para la eliminación de contaminantes que interfieran en el proceso de identificación, con agua destilada, alcohol al 70% e hipoclorito al 2%. Los análisis se realizarán en el laboratorio de sanidad vegetal de la universidad nacional, en el cual se inicia con el proceso de desinfección con las muestras recolectadas (50 semillas) iniciando con los lavados de alcohol al 70% durante 30 segundos, hipoclorito de sodio al 5% por un minutos y tres lavados por un minuto con agua destilada estéril como lo plantea Torres, et al (2008). Después las semillas son puestas en cajas de Petri según sea el tamaño de la semilla, empleando medio de agar nutritivo y PDA (Papa, Dextrosa y Agar), siguiendo la metodología de aislamiento de hongos y bacterias fitopatógenos, observando diariamente los cambios en el medio, registrando el crecimiento de las colonias obtenidas para clasificarlas por las diversas morfologías. Para cada microorganismo aislado se realizará un análisis macroscópico de manera constante, teniendo en cuenta factores como el color, textura, topografía de la colonia, color, crecimiento y formación de estructuras reproductivas (Torres et al, 2008), siguiendo los protocolos establecidos en el laboratorio de sanidad vegetal, identificando los microorganismos mediante la tinción de muestras con lactofenol, para posteriormente observar estructuras somáticas y reproductivas como conidias hifas y conidióforos teniendo en cuenta lo manifestado en las cajas de Petri, tomando las colonias sobre un portaobjetos para su visualización en el microscopio. A partir de los cultivos bacterianos y fúngicos crecidos se seleccionará una única colonia que se sembrará por agotamiento en medio agar nutritivo o PDA según sea el caso, para la obtención de un cultivo puro, para luego realizar imprentas de los resultados obtenidos, comparando las morfologías microscópicas para determinar cuál es el patogeno que afecta a la semilla.  Contemplando la posibilidad de realizar un análisis estadístico.

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- Realizar la búsqueda exhaustiva de bibliografía que nos permita reconocer los patógenos en la reproducción in vitro de frutales.
- Identificar por medio del microscopio los microorganismos más comunes en el proceso de propagación y micropropagación de semillas frutales.
- Analizar las diversas estrategias tecnológicas que permitan controlar la contaminación microbiana en la propagación y micropropagación de frutales.

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Una herramienta muy útil para la propagación de plantas que presentan dificultad para multiplicarse vegetativamente es el cultivo in vitro, consiste en una serie de técnicas de manipulación y control sobre un medio nutritivo artificial en condiciones asépticas, esta técnica permite controlar factores como división celular, germinación, brotación, enraizamiento, floración y fructificación (Hernández & González, 2010).

La contaminación microbiana es uno de los problemas más graves en la micropropagación y propagación de especies vegetales a nivel mundial produciendo tasas altas de perdida de material (Hernández & González, 2010).

Los hongos, las bacterias y levaduras son los contaminantes mas frecuentes, son perjudiciales para células, tejidos u órganos cultivados in vitro, compiten por nutrientes del medio, colonizan tejidos, liberan metabolitos tóxicos (Hernández & González, 2010).

Los explantes (parte de una planta), el ambiente de los locales de trabajo, los operadores y las técnicas deficientes de esterilización son las causas mas frecuentes de contaminación bacteriana, algunos hongos que se han detectado en yemas apicales de plantas (Hernández & González, 2010)

Aunque existe varios métodos de desinfección en la fase de establecimiento, en ocasiones no es posible eliminar los microorganismos, debido a que estos permanecen en el interior de las células, en los espacios intercelulares o en los haces conductores protegiéndose de los agentes químicos usados por lo cual se propagan en el material vegetal en la fase de establecimiento o permanecer sin expresarse por largos períodos de tiempo (Hernández & González, 2010).

Una delas causa mas comunes para contaminación microbiana es el tamaño de los explantes, ya que entre mas grandes o mas irregularidades tenga en sus superficie es más difícil de desinfectar (Hernández & González, 2010).

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Todas las semillas fueron obtenidas en Vivero Duranta, en el Municipio de Gama Cundinamarca, haciendo el ensayo con 3 repeticiones (2 en condiciones de desinfección y 1 sin desinfección).

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Montaje de semillas (con y sin desinfección)

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Montaje de semillas (con y sin desinfección)

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Resultados del ensayo en las condiciones planteadas

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Resultados del ensayo en las condiciones planteadas

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Aislamiento realizado en la caja de Petri con PDA

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Aislamiento realizado en la caja de Petri con PDA

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Luego del aislamiento realizado en la caja de Petri con PDA, en los que se formaron colonias algodonosas blancas hasta grises, de las cuales se realizaron improntas para ver las estructuras del hongo y la confirmación de este patógeno, incluido la existencia de otros como bacterias.

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Resultados - microscopio - Tomate de árbol

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Resultados - microscopio - Tomate de árbol

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Para los resultados se hace una investigación respecto a la morfología microscópica encontrada en las 3 cajas que presentaron síntomas, sin embargo, se deben realizar más pruebas y más observación para una caracterización definitiva.

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Arriagada, V. (2000). Semillas, inspección, análisis, tratamiento y legislaciónSemillas, inspección, análisis, tratamiento y legislación (No. IICA F03-03). IICA, Santiago (Chile) IICA, Santiago (Chile).

Carabalí Muñoz, A. [y otros siete]. (2021). Plagas y enfermedades de la guayaba (Psidium guajava) en Colombia. Mosquera, Colombia: agrosavia.

Giachino, M. V., Gally, T., Craig, E., Ewens, M. (2012). MICROORGANISMOS ASOCIADOS A SEMILLAS FORESTALES. UNAL (2022). Universidad Nacional de Colombia: Dirección de Laboratorios - DIRLAB - Laboratorio de Sanidad Vegetal. https://direcciondelaboratorios.medellin.unal.edu.co/index.php/nuestroslaboratorios/facultad-de-ciencias-agrarias/82#sobre-el-laboratori

Hernández, Y. y González, M. (2010). Efectos De La Contaminación Microbiana Y Oxidación Fenólica En El Establecimiento In Vitro De Frutales Perennes. Cultrop, 31(4). http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-59362010000400015#:~:text=La%20contaminaci%C3%B3n%20microbiana%20es%20uno,como%20en%20la%20micropropagaci%C3%B3n%20comercial.

Ivancovich, A. y Lavilla, M. (2016). Propuestas de escalas para la evaluación, a campo y en laboratorio, del “tizón foliar” y la “mancha púrpura de la semilla”, causadas por Cercopora kikuchii, en soja. Engormix. https://www.engormix.com/agricultura/articulos/propuestas-escalas-evaluacion-campo-t40660.htm

Ortiz, C. 2015. Fotografías de la práctica de laboratorio 5 de fitopatología de la universidad de Cundinamarca. Facatativá.

Torres, C., Correa, N. D., & Díaz, J. E. (2008). Caracterización de microorganismos fúngicos en semillas de arazá (Eugenia stipitata). Orinoquia, 12(1), 31-44. https://www.redalyc.org/pdf/896/89612104.pdf

Tunes, L. M., Pedroso, D. C., Conceição, G. M., Barbieri, A. P. P., Barros, A. C. S. A., Muniz, M. F. B., & Menezes, N. L. (2011). Tratamentos térmicos e químicos em sementes de trigo. Interciência, 36(10), 746-751.

Velásquez, R., Amador, M., Medina, M., Lara, F. (2007). Presencia de Patógenos en Almácigos y Semilla de Chile (Capsicum annuum L.) en Aguascalientes y Zacatecas, México. Revista mexicana de fitopatología, 25(1). https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0185-33092007000100010

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Los síntomas observados en campo (crecimiento en cajas de petri de 48 horas) indicaron que las estructuras potencialmente patógenas eran un hongo por la formación de colonias de algodón de color blanco a gris, que se seleccionaron para improntas y observación en el microscopio de las estructuras patógenas para determinar si se trata de un hongo, incluida la posibilidad de encontrar otros patógenos como bacterias.

Arriagada (2000) afirma que la observación posterior a la detección permite la identificación directa u ofrece la posibilidad de realizar pruebas especiales que pueden requerir tiempos de incubación para expresar y rastrear el patógeno. En este caso, se utilizó medio PDA para demostrar mejor las propiedades macroscópicas de la colonia fúngica.

El método se llevó a cabo en cada una de las especies seleccionadas, a saber, guayaba fresa (Psidium Cattlianum) y tomate de árbol (Solanum betaceum): se cultivaron en agar semillas desinfectadas y no desinfectadas. En el estudio se hallaron problemas de patógenos en las semillas no desinfectadas de ambas especies, y en las semillas desinfectadas los patógenos solo estuvieron presentes en la guayaba fresa, se encontró Pestalotiaversicolor en la guayaba fresa y Phytophthora infestans en el tomate de árbol, por lo tanto, es evidente que los patógenos son fáciles de encontrar en las semillas, de acuerdo con Velásquez et al. (2007). En este caso, semillas de guayaba fresa (Psidium Cattlianum) y tomate de árbol (Solanum betaceum). En estas condiciones, se acepta la hipótesis propuesta, ya que se ha confirmado que la contaminación microbiana es un factor bastante limitante en la reproducción de las plantas (Hernández y González, 2010), situación que se evidencio en el ensayo.

En los resultados se evidencio el crecimiento de bacterias y hongos, de los cuales al tomar una pequeña muestra de las semillas y según lo obtenido según Arriagada, (2000) se pueden realizar tratamiento fungicidas porque se encontraron organismos asociados a la semilla, lo mismo en el caso de las bacterias aplicando antibióticos que inhiban su desarrollo.

Es necesario realizar un examen fitosanitario de las semillas portadoras de patógenos para poder tomar decisiones adecuadas sobre las semillas y evaluar métodos de tratamiento alternativos para el control efectivo de enfermedades.

Según Arriagada, (2000) las desinfecciones son factibles como rutina comercial conforme sea el caso, ya que existen diversos métodos de desinfección incluyendo métodos de aplicación diversos, que en su mayoría son químicos, pero en el ensayo se realizaron suspensiones concentradas como un tratamiento de inmersión.

Gracias a la caracterización mencionada se hicieron improntas seleccionando la colonia con más síntomas en atmósfera de cultivo, lo que nos llevó a caracterizar dos hongos, en el tratamiento de la guayaba con y sin desinfección se encontró estructuras correspondientes a roña, identificada por su unión de conidias (Carabalí, et al, 2021). El otro patógeno corresponde a Phytophthora infestans en tomate de árbol, que tiene una estructura idéntica a la señalada por Ortiz (2015), con micelio cenocítico, paredes paralelas, hifas ramificadas y macroconidios.

Las conclusiones permiten implementar estrategias tecnológicas que controlen la colonización microbiana en la propagación y micropropagación de frutales, como cultivo in vitro que permite que la plántula crezca en condiciones controladas y estériles (Hernández & González, 2010). Explantes de estirpe confiable en las cuales se pueden efectuar pruebas de dictamen para detectar patógenos específicos anterior a la propagación, como se realizó en el ensayo.

Del mismo modo, la implementación de tratamientos químicos como soluciones desinfectantes antes de la propagación descartando la presencia de patógenos y en conveniencia el uso de tratamientos térmicos en los cuales los explantes se exponen a diferentes temperaturas (frio y calor), para eliminar patógenos presentes, siempre y cuando las condiciones de la semilla lo permitan (Tunes et al, 2011).

Frente a los objetivos trazados para la investigación, se cumplen de manera satisfactoria la búsqueda bibliográfica del reconocimiento de patógenos en la reproducción in vitro con los frutales escogidos (Rubus ulmifolius, Physalis peruviana y Psidium cattleianum, Solanum betaceum).

También se logró la identificación de microorganismos por medio del microscopio mediante la realización de improntas, concordando con las enfermedades que nos expresa la bibliografía, ya que son enfermedades comunes en los frutales y que además son limitantes para el cultivo, de manera que una identificación temprana ayuda a un mejor manejo en campo evitando sobrecostos y mantener un buen manejo fitosanitario dentro del cultivo con una propagación de alta calidad.

Asimismo se analizaron diversas estrategias tecnológicas para el control de la contaminación microbiana en la propagación y micropropagación de frutales, la principal es el cultivo in vitro en condiciones controladas, en las cuales se utilizan cámaras de flujo laminar que permiten un ambiente estéril que disminuye la exposición de las semillas a microorganismos presentes en el ambiente o incluso por contaminación cruzada, que va de la mano con el uso de técnicas de cultivo asépticas (condiciones estériles y desinfección estricta).

Igualmente, dentro de la búsqueda bibliográfica se encontraron técnicas como cultivo de meristemos apicales, estrategia que ya se ha utilizado en frutales como Carica papaya, que consiste en un crecimiento activo, mínima contaminación por sus ambientes asépticos que conlleva a obtener plantas libres de fitopatógenos al igual que vigorosas, siendo una gran opción para una propagación y micropropagación sin contaminantes implementando técnicas in vitro (Solis y La Rosa, 2011). Para el caso de Physalis peruviana, se ha utilizado micropropagación in vitro de yemas axilares mediante el uso de reguladores de crecimiento, lo que permite una multiplicación, enraizamiento y elongación de brotes favorable, alcanzando un crecimiento y desarrollo ideal en la planta sin presencia de microorganismos contaminantes (Rivera y Moya, 2016).

Por último, está el mantenimiento preventivo en la propagación y micropropagación lleva a tener una gestión adecuada de las semillas ya sea en medios de cultivo o rotación de cultivos, que sean monitoreados constantemente en su desarrollo, para generar un control ante la aparición de síntomas por patógenos o contaminación microbiana (Picado, 2007).

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En conclusión, se pudo comprobar con el estudio realizado en laboratorio la gran incidencia que tiene la infección microbiana en la propagación de frutales y otras especies, evidenciando con este fenómeno que la eficiencia del material vegetal a germinar baja significativamente, debido a que en muchas plantaciones se presentan problemas de fitopatógenos y si no se realiza buenas prácticas de asepsia en los viveros, esto puede ocasionar enormes pérdidas en la propagación y micropropagación de material vegetal.

La asepsia de las semillas debe ser desde el momento en que se recolectan, siendo llevadas en un contenedor estéril, hasta cuando se llegue a la zona de desinfección, esta cadena no se debe perder, debido a que de camino al vivero se pueden contaminar con algún tipo de patógeno presente en el aire o superficies sin desinfectar que puedan tener contacto con estas.

Los objetivos planteados para la investigación se cumplieron parcialmente, debido a que sí se identificó la influencia microbiana en los procesos de propagación, pero sin embargo no se logró analizar estrategias tecnológicas eficientes para controlar la contaminación microbiana en la propagación de semillas de frutales.

El proceso de desinfección de las semillas puede evitar enfermedades vegetales transmitidas por semillas contaminadas y disminuir posibles riesgos de patógenos en las semillas, sin embargo hay que tener en cuenta el tipo de semilla y analizar que tipo de desinfección es pertinente.

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Solis, R., Olivera, J., & La Rosa, R. S. (2011). Propagación in vitro de Carica papaya var. PTM-331 a partir de meristemos apicales. Revista peruana de biología, 18(3), 343-348.

Rivera Herhuay, L., & Moya González, D. A. P. G. (2016). MICROPROPAGACIÓN IN VITRO DE YEMAS AXILARES DE Physalis peruviana L. MEDIANTE EL USO DE REGULADORES DE CRECIMIENTO.

Picado, G. (2007). Manuales de mantenimiento preventivo para las plantas de concentrados, granos y semillas de Zamorano.