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1. Primero de informa al paciente sobre la prueba, para qué sirve y los riesgos que implica.

2. Un alergólogo junto con una enfermera realizaran pruebas cutáneas y de exposición a alimentos y fármacos, usando inicialmente dosis pequeñas

3. En las pruebas relacionadas con medicamentos, se administrará por la vía más segura según cada situación, oral o intravenosa. Cuando sea necesario se fraccionará la dosis, según la reacción adversa documentada  y el tipo de fármaco a estudiar.

4. Una vez acabadas las pruebas, el paciente tiene que estar unas horas en observación  para diagnosticar las reacciones no inmediatas

# data[].attributes.body
- Se realizan estudios de investigación, para ver que componentes producen reacción.

- Tienen riesgos elevados, hasta producir la muerte por asfixia.
- No se debe realiza la prueba, sin el consentimiento del paciente.

# data[].attributes.body
Debemos estar muy pendientes ya que el paciente puede tener una reacción alérgica en cualquier momento.

Para realizar una prueba  de exposición se tiene que valorar la relación riesgo-beneficio, por ejemplo en el caso de estudios con medicamentos, solo se harán con fármacos importantes.

# data[].attributes.body
En esta técnica no hay un tiempo estimado para los resultados, ya que el resultado se debe a cuando se produce la reacción con la ingesta de alimentos o medicamentos

# data[].attributes.body
Positivo: momento en el que se produce la reacción a la hora de ingerir algún alimento o medicamento.
Negativo: cuando a la hora de ingerir algún alimento o medicamento no produce ninguna reacción.

# data[].attributes.body
- Extracción de sangre venosa o bazo de ratones.
- Preparación de medios de cultivo donde contengan antígenos de interés.
- Traz el periodo de proliferación, se observan la concentración de células con una cámara de Neubauer.
-A depender del índice de Estimulación, se diagnostica una alergia o no.

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En un estudio en Brazil para la detección de alérgenos al níquel, han sido empleadas 19 muestras de pacientes positivos para al níquel y 25 controles sin níquel.
Los resultados fueron concluyentes para creditar la técnica para la detección de níquel; todas las 19 muestras han reaccionado y proliferado linfocitos, los 25 controles negativos no han reaccionado, asegurando así, la técnica ser sensible, precisa y efectiva.

Estudio disponible en: https://www.scielo.br/j/abd/a/3GVhnrQ3FnJG4fPhQgnz4pc/?lang=pt#

(Imagen representando las 19 muestras positivas en diferentes concentraciones)

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Para el cultivo celular in vivo, se utiliza el bazo de los ratones, extraídos tras eutanásia.

# data[].attributes.body
El recuento celular para calcular la concentración es hecha con una cámara de Neubauer.

# data[].attributes.body
Positivo: cuando el índice de estimulación es mayor que 3. (IE >3).

Negativo: cuando el índice de estimulación no supera el mínimo para se considerar positivo (IE >3).

# data[].attributes.body
En los test in vivo, normalmente empleando ratones, son inyectados antígenos y tras siete días, los ratones sufren eutanasia para que se estudie sus linfocitos, los mismos van a ser cultivados en placa Petri en medios con antibióticos y otros antígenos de interés para apaliar la proliferación de las células linfocíticas. Ya para la prueba de níquel, se utiliza sangre venosa extraída y plaqueada del paciente para mensurar la proliferación de las células linfocíticas. El fundamento de las dos técnicas se basa en el mecanismo de proliferación linfocítica frente al estimulo de un antígeno, resultando en una respuesta inmune que se torna mensurable con sus concentraciones en una placa de cultivo. El resultado es transformado en índice de estimulación y en porcentaje.

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La prueba de transformación linfoblástica (o linfocitaria) surge de la necesidad de testes más sensibles y específicos para el níquel (información disponible en: https://www.scielo.br/j/abd/a/3GVhnrQ3FnJG4fPhQgnz4pc/?lang=pt) y para realizar estudios acerca de la sensibilidad de los linfocitos in vivo frente a alérgenos.
La prueba tiene como objetivo mensurar la capacidad de proliferación de los linfocitos cultivados en placas Petri por medio de estímulos mitógenos (que inducen a la mitosis) y el contacto con los antígenos de interés.

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INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Estudo da proliferação linfocitária em pacientes sensibilizados ao níquel

Ana Paula Galli SanchezI; Celina Wakisaka MarutaII; Maria Notomi SatoIII; Ricardo Luiz RibeiroIV; Carolina de Almeida ZomignanV; Ricardo Spina NunesVI; Vitor Manoel Silva dos ReisVII

I Mestra, Médica Assistente do Serviço de Dermatologia do Complexo Hospitalar Padre Bento de Guarulhos (SP)

II Professora Doutora do Departamento de Dermatologia da FMUSP (SP)

III Professora Doutora do Departamento de Dermatologia da FMUSP e pesquisadora do LIM-56, Biomédica

IV Mestre, Pediatra, Professor do Departamento de Saúde Pública da Faculdade de Medicina de Santo Amaro (SP)

V Técnica do Laboratório de Investigação em Dermatologia e Imunodeficiências (LIM 56) da FMUSP (SP)

VI Biólogo do Departamento de Dermatologia do HC-FMUSP (SP)

VII Professor Doutor do Departamento de Dermatologia do HC-FMUSP (SP)

Endereço para correspondência

RESUMO

FUNDAMENTO: O diagnóstico da alergia ao níquel é estabelecido com a realização do teste de contato.

OBJETIVO: Desenvolver um método diagnóstico mais sensível e específico.

CASUÍSTICAS E MÉTODOS: Dezenove pacientes com teste de contato positivo para o níquel e 25 controles foram submetidos ao teste da proliferação linfocitária. As células mononucleadas foram isoladas do sangue venoso periférico e cultivadas em triplicatas, em placas de cultura (2x10 ⁵ células/orifício) com: meio de cultura apenas; sulfato de níquel (156,25; 78,13; 19,53; 9,77 e 2,44µM) e concentrações ideais do antígeno Candida albicans e dos mitógenos pokeweed, fito-hemaglutinina A e anticorpo anti-CD3 (OKT3). Timidina tritiada foi adicionada às placas, a radioatividade incorporada pelas células medida e os resultados expressos pelo índice de estimulação (IE).

RESULTADOS: A resposta proliferativa dos linfócitos dos casos foi superior à dos controles em todas as concentrações de níquel testadas. Considerando teste positivo para níquel quando IE > 3, nenhum dos controles e 16 (84,21%) dos casos apresentaram teste positivo em pelo menos uma das cinco concentrações usadas. As respostas à Candida albicans e aos mitógenos foram semelhantes nos casos e controles, demonstrando a integridade da imunidade celular em ambos os grupos.

CONCLUSÃO: O teste da proliferação linfocitária mostra-se útil no diagnóstico da alergia ao níquel.

Palavras-chave: Ativação linfocítica; Dermatite de contato; Níquel.

INTRODUÇÃO

O níquel é o principal causador de dermatite alérgica de contato (DAC) no Brasil e no mundo industrializado. 1,2 Segundo estudo multicêntrico, 25,1% da população brasileira estudada apresentava sensibilização ao níquel. ¹ A DAC por níquel predomina no gênero feminino, em pacientes jovens e não atópicos. 3,4

O diagnóstico da DAC por níquel é baseado na história e quadro clínico do doente, sendo corroborado pela realização do teste de contato (TC) com sulfato de níquel a 5% em vaselina sólida. ¹

Apesar de a técnica de execução do TC estar bem definida, o resultado depende da montagem, aplicação e leituras corretas do teste. O paciente não pode molhar o local da aplicação e deve comparecer três vezes ao hospital para sua execução. O TC exige controle clínico prévio da dermatose para sua realização, pode produzir exacerbação da dermatite e não deve ser empregado em pacientes em uso de corticóide sistêmico. O uso de corticóide tópico no local do teste nos últimos 15 dias e a exposição recente do dorso ao sol também contra-indicam sua realização. ¹

Além disso, a aplicação do níquel em vaselina na pele pode produzir lesões foliculares e pustulosas como reações irritativas, bem como resultados duvidosos e falso-negativos. 4,5

Outro método diagnóstico citado na literatura, porém com resultados variados e controversos, é o teste da proliferação linfocitária - TPL. ⁶⁻²⁴ No TPL, os linfócitos do sangue periférico do paciente são colocados em contato com o níquel. Se o paciente for sensibilizado ao metal, seus linfócitos de memória circulantes são ativados, sintetizam DNA e se dividem. A proliferação celular é medida pela incorporação de timidina radiomarcada pelas células ativadas.

Nos primeiros relatos sobre o TPL em indivíduos sensibilizados ao níquel, os autores utilizaram cloreto e acetato de níquel. 6,7,9 Resposta proliferativa linfocitária inespecífica nos casos e nos controles foi comum, ou seja, o níquel funcionava como mitógeno, estimulando tanto os linfócitos dos pacientes sensibilizados quanto os dos controles não sensibilizados. 6,9

Posteriormente, a maioria dos trabalhos foi feita com o sulfato de níquel, 8,10,11,13-23 porém não há padronização na literatura das concentrações de células e de níquel empregadas, sendo também comum a ocorrência de resultados falso-positivos. 10,14,15,17-23

Para melhor interpretar os resultados já publicados, os autores realizaram o TPL com sulfato de níquel em cinco concentrações, utilizando amostras do sangue venoso periférico heparinizado de 44 indivíduos.

CASUÍSTICA E MÉTODOS

Casos - 19 pacientes do gênero feminino, com idade variando entre 15 e 71 anos (média 38,42 anos; mediana 37 anos), com história de sensibilização ao níquel e/ou lesões sugestivas de eczema de contato ou disidrose por níquel. Após controle clínico da dermatose, o diagnóstico da DAC por níquel foi confirmado pela realização do TC. ¹ Observando-se leitura positiva para o sulfato de níquel após 96 horas, foi agendada data oportuna para a coleta de 15ml de sangue venoso periférico do paciente para a realização do TPL.

Controles - 25 indivíduos (sete do gênero masculino e 18 do feminino), com idade variando entre 18 e 50 anos (média 30,84 anos; mediana 26 anos), sem história de sensibilização ao níquel e com TC negativo para sulfato de níquel. Após realização do TC, foi agendada coleta do sangue para execução do TPL.

Na primeira consulta, os pacientes de ambos os grupos foram informados sobre a finalidade do estudo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Considerou-se critério de exclusão o uso de corticóide sistêmico até três semanas antes da realização do TC.

TC - Feito com a bateria padrão brasileira composta por 30 substâncias, que foram aplicadas em câmaras de alumínio do tipo Finn Chamber ® (Epitest Ltd, Finland) nas concentrações e quantidades padronizadas e fixadas na pele sã do dorso do paciente. O paciente foi orientado a não molhar o local e retornar ao hospital 48 horas após a colocação do teste, quando o material foi retirado, sendo feita a primeira leitura. Passadas mais 48 horas, o paciente retornava para a segunda leitura. A montagem, a aplicação e as duas leituras dos testes de todos os pacientes foram feitas por um único examinador. Os critérios de leitura adotados foram os estabelecidos pelo International Contact Dermatitis Research Group: ²⁵ negativo (-): sem reação; duvidoso (+?): eritema leve mal definido; positivo fraco (+): eritema definido e pápula; positivo forte (++): eritema, pápula e vesícula; positivo muito forte (+++): eritema, pápula, vesículas coalescentes formando bolha. Foram consideradas positivas para sensibilização as reações positivas em 48 e 96 horas, bem como as negativas em 48 horas e positivas em 96 horas. Foram consideradas negativas para sensibilização tanto as reações negativas em 48 e 96 horas quanto as positivas em 48 horas e negativas em 96 horas.

TPL - Realizado no LIM 56 da FMUSP. Trabalhando em fluxo laminar, as células mononucleadas eram isoladas do sangue do paciente por gradiente de densidade, utilizando-se a solução de Ficoll-Hypaque. ²⁶ Após lavagem das células (centrifugação em soro fisiológico), as mesmas eram colocadas em tubo de ensaio com o meio de cultura (RPMI 1640). Em seguida, uma amostra era levada para contagem automática das células no aparelho Cell Dyn 1400. As culturas foram realizadas com 2x10 ⁶ células mononucleadas/ml, em triplicatas, em placas de 96 orifícios com fundo chato (Costar ® 3596, New York, USA). Cada orifício apresentava em seu interior volume total de 200µl: 100µl de células em RPMI 1640 enriquecido com 10% de soro humano AB (2x10 ⁵células/orifício) e 100µl do antígeno ou mitógeno a ser testado diluído em RPMI 1640. Para cada paciente montou-se uma triplicata apenas com 100µl de células em RPMI 1640 com soro AB e 100µl de RPMI 1640. Essa triplicata, sem a presença de mitógeno ou antígeno, foi denominada "basal". Com relação ao níquel, utilizou-se solução padrão de sulfato de níquel em água destilada a 1M. Essa solução foi diluída em RPMI 1640, e várias diluições desta última solução foram realizadas, sendo 156,25; 78,13; 19,53; 9,77 e 2,44µM as concentrações finais do níquel usadas. As células foram, portanto, cultivadas (2x10 ⁵/orifício) por seis dias, em triplicatas, a 37ºC, em atmosfera de 5% de CO ₂, na presença de: 100µl de meio de cultura apenas (basal), 100µl de cada uma das cinco concentrações do sulfato de níquel e 100µl de concentrações ideais do antígeno Candida albicans (CMA-5µg/ml) e do mitógeno pokeweed (PWM-5µg/ml). Também foram avaliadas, separadamente, as respostas proliferativas das células na presença dos mitógenos fito-hemaglutinina A (PHA-2,5µg/ml) e anticorpo anti-CD3 (OKT3-1/400) em culturas de três dias, sendo também montada uma triplicata basal para cada paciente nessas placas de cultura. As culturas com a CMA e com os mitógenos citados foram realizadas para avaliar a integridade da imunidade celular em ambos os grupos. Um antígeno, como a CMA ou o níquel, induz a proliferação de linfócitos periféricos de indivíduos previamente sensibilizados a ele, enquanto um mitógeno estimula a proliferação linfocitária sem reconhecimento específico. Assim, PHA estimula a ativação policlonal de linfócitos T (LT); PWM estimula tanto os LT quanto os linfócitos B; e OKT3 estimula a proliferação de LT. ²⁶ Dezoito horas antes do término dos cultivos, timidina tritiada (3H-thymidine, Amershan Pharmacia Biotech, UK; specific activity 25Ci/mmol) diluída em RPMI 1640 (1:100) foi adicionada em cada orifício das placas de cultura. Completado o período de incubação, as culturas foram aspiradas com auxílio de coletor de células automático (Cell-Harvester, Skatron Instruments, UK), sendo o material radioativo incorporado às células em proliferação transferido para membranas de fibra de vidro. As membranas foram envolvidas por envelopes plásticos, onde se adicionou líquido de cintilação. Após secas em estufa, foram colocadas no contador de cintilação beta (Betaplate, Wallac, Finland). De acordo com os resultados fornecidos pelo aparelho em contagens por minuto (cpm) da radioatividade incorporada pelas células, foi possível definir se houve ou não ativação e proliferação linfocitária. A média das cpm de cada triplicata foi calculada, e os resultados, expressos pelo índice de estimulação (IE). O IE é calculado dividindo-se a média das cpm das triplicatas estimuladas (com um antígeno ou mitógeno) pela média das cpm das triplicatas basais correspondentes.

Métodos estatísticos - Por meio do teste de Mann-Whitney ²⁷ compararam-se os grupos de casos e de controles nas seguintes variáveis: valores das médias das cpm das triplicatas basais, valores do IE nas cinco concentrações do sulfato de níquel testadas, valores do IE na presença da CMA e dos mitógenos (PHA, OKT3 e PWM). Como nível de significância convencionou-se a probabilidade 0,05 ou 5% (risco a < 0,05). O coeficiente de correlação de Spearman (r s) ²⁷ foi utilizado no grupo de casos para correlacionar a intensidade da resposta do TC com a intensidade da resposta do TPL e para verificar se o tempo (em dias) entre a realização do TC e a realização do TPL influenciou o resultado deste último. Quando o coeficiente de explicação (r s ²) foi superior a 0,80, considerou-se boa a correlação entre os dados. Os valores estatisticamente significantes estão assinalados nas tabelas com um asterisco (*).

RESULTADOS

Com relação ao TC, no grupo de casos, um paciente apresentou teste positivo fraco (+), 11 apresentaram testes positivos fortes (++), e sete positivos muitos fortes (+++) para o níquel. Nove dos 19 pacientes sensibilizados ao metal apresentaram TC positivo para mais um alérgeno: timerosal, etilenodiamina, cloreto de cobalto ou bicromato de potássio ( Quadro 1). No grupo controle, três pacientes apresentaram TC positivo para timerosal, tiuram-mix e carba-mix, respectivamente ( Quadro 2).

As tabelas 1 e 2 reúnem os resultados do TPL com níquel no grupo de casos e controles. Nas cinco concentrações do níquel utilizadas, a diferença entre os resultados do TPL nos casos e controles foi estatisticamente significante ( Tabela 3). O TPL foi considerado positivo para o sulfato de níquel quando o IE > 3. Esse valor foi estabelecido considerando-se os valores da média (1,25) mais três desvios padrões (1,77) dos valores dos IE dos controles na presença do níquel a 78,13µM, em que se observaram os valores mais elevados do IE nos controles.

Dezesseis dos casos (84,21%) apresentaram TPL positivo em pelo menos uma das concentrações de níquel testadas. Em 15 desses 16 pacientes o IE foi superior a três quando utilizado o sulfato de níquel a 78,13µM. Apenas os linfócitos do caso número 14 não responderam nessa concentração, proliferando na presença do níquel a 156,25µM ( Tabela 1). O pico da resposta proliferativa linfocitária dos casos ocorreu na presença do níquel a 78,13µM, atingindo o IE o valor 49,87 ( Tabela 1).

O gráfico 1 ilustra a distribuição dos valores dos IE dos TPL com o níquel nos dois grupos, demonstrando, claramente, que as respostas proliferativas dos linfócitos dos casos foram muito superiores às dos controles nas cinco concentrações testadas.

Três dos casos (números 3, 16 e 17) não apresentaram TPL positivo nas cinco concentrações de sulfato de níquel testadas ( Tabela 1).

Nenhum dos controles apresentou TPL positivo para o níquel ( Tabela 2). O pico da resposta proliferativa nos controles também ocorreu na presença do sulfato de níquel a 78,13µM, onde o IE atingiu o valor 2,75 ( Gráfico 1 e Tabela 2).

As respostas aos mitógenos PHA, OKT3 e PWM e ao antígeno CMA em ambos os grupos foram semelhantes, demonstrando a integridade da imunidade celular nos casos e controles ( Tabelas 4 e 5). Não houve diferença estatisticamente significante entre os valores das médias das cpm das triplicatas basais das culturas dos casos e controles de seis e de três dias.

Utilizando o valor da diferença em dias entre a realização dos dois testes e a intensidade das respostas do TC e do TPL, estudou-se a correlação entre a intensidade da resposta do teste in vivo e in vitro, e se o tempo entre a realização do TC e do TPL influenciou a intensidade da resposta do TPL. De acordo com o estudo estatístico, não houve correlação entre a intensidade dos resultados da segunda leitura do TC (+, ++ ou +++) e a intensidade das respostas do TPL (expressas em IE) nas cinco concentrações de níquel usadas. Além disso, o tempo (em dias) entre a realização do TC e do TPL também não influenciou o resultado (valor do IE) do TPL ( Tabela 6).

DISCUSSÃO

Na tentativa de desenvolver um teste laboratorial mais sensível e específico para o diagnóstico da DAC por níquel, desde a década de 1960, vários trabalhos foram publicados sobre o TPL com acetato, 9,11,14 cloreto 6,7,12,24 e sulfato de níquel. 8,10,11,13-23,28

A comparação dos resultados desses trabalhos é de difícil realização, uma vez que os pesquisadores utilizaram células mononucleadas em diversas concentrações e níquel em soluções e concentrações variadas ( Quadro 3). No entanto, esses trabalhos permitiram o isolamento de clones de LT específicos no reconhecimento do níquel e a realização de estudos sobre a imunopatogênese da DAC por níquel. Vale ressaltar que, mesmo sendo o níquel o principal causador de DAC no mundo, ainda não se tem conhecimento exato de como ocorre a apresentação antigênica. ²⁹

Segundo Gimenez-Camarasa et al., ¹³ quando diluições seriadas de sulfato de níquel são utilizadas para a execução do TPL, a sensibilidade do teste aumenta. Considerando esse dado, os autores realizaram o TPL com cinco diluições da solução padrão de sulfato de níquel.

Neste trabalho, 16 (84,21%) dos 19 pacientes sensibilizados ao níquel apresentaram TPL positivo (IE > 3) em pelo menos uma das cinco concentrações testadas. No entanto, nos casos números 3, 16 e 17, o teste foi negativo. Para os linfócitos desses pacientes, talvez as concentrações do níquel empregadas não tenham sido ideais para induzir resposta proliferativa. Pequeno número de LT circulantes de memória ou número insuficiente de células apresentadoras de antígeno isoladas do sangue podem também justificar os resultados falso-negativos. Outra possibilidade é que nesses pacientes os linfócitos de memória se concentrem mais na pele.

Dos 16 casos com TPL positivos, 15 apresentaram IE > 3 quando seus linfócitos foram cultivados na presença do sulfato de níquel a 78,13µM ( Tabela 1). Apenas os linfócitos do caso número 14 não responderam nessa concentração, proliferando na presença do níquel a 156,25µM. No futuro, realizando o TPL em um número maior de casos e controles os resultados poderão ser confirmados, e a padronização da técnica com estas duas concentrações poderá ser feita, facilitando sua execução.

Não se observaram no grupo controle resultados falso-positivos, ao contrário da maioria dos trabalhos publicados ( Quadro 3). Esses resultados considerados falso-positivos, na verdade, podem ter ocorrido, talvez, em indivíduos já sensibilizados, ou seja, o TPL teria identificado a presença de sensibilização em limiar ainda insuficiente para produzir lesões cutâneas e TC positivo.

De acordo com os resultados do TPL nos dois grupos e utilizando o TC como método diagnóstico de referência, a sensibilidade do TPL com sulfato de níquel nas cinco concentrações testadas foi 84,21%, e a especificidade, 100%. A especificidade do TPL com o sulfato de níquel foi corroborada pela realização do teste com as células mononucleadas de três controles com TC negativo para o sulfato de níquel, porém positivos para timerosal, tiuram-mix e carba-mix ( Quadro 2 e Tabela 2).

No grupo de casos, os quatro valores mais elevados do IE (49,87; 34,02; 31,81 e 23,21) foram observados nos pacientes números 8, 18, 4 e 19, respectivamente, sensibilizados ao níquel e a mais um alérgeno ( Quadro 1 e Tabela 1). Talvez a polissensibilização influencie a intensidade da resposta proliferativa linfocitária, sendo necessária a realização de estudo em maior número de pacientes sensibilizados ao níquel e a outros alérgenos para melhor interpretação dessa observação.

O TPL é ensaio que depende de treinamento rigoroso para o isolamento das células mononucleadas, bem como para a preparação e utilização correta dos mitógenos, antígenos, meio de cultura e materiais radioativos. É essencial também a manutenção e manuseio correto dos aparelhos. Dessa maneira, para a realização do TPL é necessária uma infra-estrutura de material e pessoal bastante elaborada.

Por outro lado, a execução do TPL em local que já possua toda a infra-estrutura necessária não é cara. Além disso, o paciente deve comparecer ao hospital apenas uma vez para a coleta do sangue. Considerando o desconforto que o TC gera no paciente, com restrições quanto ao banho e atividade física, bem como o tempo que o paciente gasta para a realização do TC, abandonando suas atividades de rotina três vezes em uma semana para concluir o exame, pode-se avaliar como vantajoso o custo do TPL.

Enquanto o TC exige controle clínico da DAC para sua realização, o TPL pode ser feito em pacientes com lesão. É consenso na literatura que essa seria a principal vantagem do TPL em relação ao TC. A amostra do sangue pode ser colhida, e o tratamento em seguida instituído, sem que o paciente corra o risco de apresentar exacerbação do quadro cutâneo durante a execução do exame. Além disso, enquanto os resultados do TC são expressos em cruzes, o TPL fornece os resultados em índices numéricos, o que favorece uma interpretação mais objetiva dos dados.

São poucos os trabalhos que correlacionam a intensidade do resultado do TC com a intensidade da resposta do TPL. Segundo Al-Tawil et al. ²⁸ e Everness et al., ²² não há correlação entre os resultados do TC e os do TPL nos pacientes sensibilizados ao níquel. No entanto, Von Blomberg-van der Flier et al., ²¹ estudando um número menor de pacientes sensibilizados, verificaram correlação entre as respostas dos testes, ou seja, os pacientes com TC fortemente positivos apresentaram IE mais elevados.

É complicado comparar as respostas de dois testes cujos resultados são dependentes de mecanismos distintos. Enquanto no TC a aplicação do níquel na pele gera um processo inflamatório com recrutamento para o local de linfócitos capazes de reconhecer o metal, no TPL os linfócitos de memória são extraídos do sangue. De qualquer maneira, também foi avaliado se havia correlação entre os resultados do teste in vivo e os do teste in vitro nos pacientes sensibilizados, sem que se constatasse correlação entre as respostas dos dois testes ( Tabela 6).

Na literatura apenas dois trabalhos discutem a influência da realização do TC no resultado do TPL, ou melhor, se o TC pode funcionar como booster e intensificar a resposta proliferativa linfocitária. 16,22 Seus autores demonstraram que a realização do TC antes do TPL não influenciou a resposta proliferativa dos linfócitos dos pacientes de ambos os grupos. Neste estudo, analisou-se a possibilidade de o tempo entre a realização do TC e do TPL ter influenciado o resultado do TPL no grupo de casos. Não houve correlação do intervalo de tempo (em dias) entre os exames com os resultados dos TPL (em IE). Portanto, intervalos mais curtos entre os dois testes não induziram respostas mais intensas nos testes in vitro ( Tabela 6), corroborando os achados anteriores.

CONCLUSÃO

Considerando os dados apresentados, pode-se concluir que o TPL mostra-se útil para o diagnóstico da DAC por níquel, especialmente em pacientes com lesões ativas. Além disso, pode ser utilizado para o isolamento de clones de LT sensibilizados ao níquel, bem como para a realização de estudos sobre as citocinas produzidas pelas células ativadas. Portanto, o TPL pode ser útil não apenas como método diagnóstico, mas também para a melhor compreensão da imunopatogênese da DAC por níquel. q

Recebido em 05.01.2005.

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 03.03.2005.

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Estudo da proliferação linfocitária em pacientes sensibilizados ao níquel

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INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA Estudo da proliferação linfocitária em pacientes sensibilizados ao níquel Ana Paula Galli SanchezI; Celina Wakisaka MarutaII; Maria Notomi SatoIII; Ricardo Luiz RibeiroIV; Carolina de Almeida ZomignanV; Ricardo Spina NunesVI; Vitor Manoel Silva dos ReisVII I Mestra, Médica Assistente do Serviço de Dermatologia do Complexo

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Estos resultados suelen tardar entre 15/20 min ya el cuerpo reacciona rápidamente. Sin embargo los resultados del análisis de sangre pueden tardar varios días

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Positivo: Cuando los valores de histamina son superiores a los valores referenciales. Valores de referencia 25/65 ng/ml.
Negativo: Los valores se encuentran dentro de los valores de referencia de la histamina

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- En primer lugar, se extrae la muestra de sangre del paciente.
- Se incuba la mezcla.
- Se lava la placa para que la histamina quede adherida a la matriz.
- Se determina por métodos flourométricos o RIA.

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La extracción de sangre, se realiza, cuando la piel haya reaccionado con el alergeno introducido, ya que así se puede medir correctamente los niveles de histamina y comprobar el grado de gravedad de dicha alergia.

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¿QUÉ RELACIÓN TIENE LA MIGRAÑA CON LA HISTAMINA?

Según un estudio, existe una conexión clara entre histamina y migraña ya que la histamina es un mediador químico de la migraña.

¿QUÉ RELACIÓN EXISTE ENTRE HISTAMINA Y SISTEMA DIGESTIVO?

Según un artículo publicado en 2005, la histamina guarda relación con la enfermedad inflamatoria intestinal. Además de eso dice, que se observaron altos niveles de histamina en pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

Otro tipo de investigaciones realizadas por científicos relatan, que han confirmado que la histamina, podría ser responsable de la diarrea en la enfermedad inflamatoria intestinal.

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Día 1: Una serie de alérgenos van a ser adheridos en el dorso del paciente. Una vez adheridos, el paciente no puede sudar o hacer actividades que pongan los parches en riesgo de despegarse, incluso ducharse.

Día 3: Puede ducharse con una esponja en el dorso, teniendo cuidado para que los parches no se despeguen. Ducharse como tal continua proibido, nadar y hacer ejercicios físicos intensos también.

Día 3 en el consultorio: El paciente retorna al consultorio para evaluar las respuestas inmunes, los parches son despegados y la piel es marcada con rotulador.

Días 3-5: No frotar el dorso con la toalla después de ducharse, evitando la zona de los parches. Está proibido lavar las marcas de rotulador del dorso para que no se quiten.

Día 4- 5: El paciente retorna otra vez al consultorio para realizar su diagnostico final, pues algunas respuestas a los alérgenos tardan más en aparecer en la piel.

Día 5-7: El paciente debe retornar al consultorio en caso de que alguna reacción alérgica tardia le ocurra.

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Los resultados son de fácil interpretación, visto que en cada patch hay un alérgeno, la piel va a reaccionar con los alérgenos, resultando en una inflamación rojiza, como una dermatitis.

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Como se ha descrito en la prueba anterior, los resultados tardan varios días, ya que hay que comprobar los niveles exactos de inmunoglobuinas. Y así tener un diagnóstico más certero.

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La pruebas de exposición a un alimento o medicamento se debe realizar en los casos en que las pruebas cutáneas o en sangre no sean suficientes para un diagnóstico definitivo.
Son procedimientos diagnósticos alergológicos que consiste en la administración de forma controlada de sustancias que son sospechosas de reacciones alérgicas en el paciente. Nos van a indicar con fiabilidad si el paciente es alérgico a determinado alimento medicamento.

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Los resultados de esta técnica, tardan varios días, porque no solo se comprueba la reacción del alergeno sino el nivel de triptasa, que determina el grado de alergia.

# data[].attributes.body
-Centrifugamos la sangre, para separar sus componentes.
-Llevamos una muestra al microscopio para poder observar mejor todas las células.
-Con otra muestra centrifugada, se introduce en un analizador automático de sangre.
-Finalmente nos darán los niveles de cada componente, en este caso los de la inmunogtobulina IgE normal y especifica.

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Extracción de sangre:
-Aguja esterilizada.
-Alcohol.
-Algodón.
-Cinta torniquete.
-Tubo de muestra.
-Jeringa esterilizada
Análisis de sangre:
-Centrifugadora
-Microscópio
-Máquina de medir niveles en sangre (Analizador automático)

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-Se realiza a todas las edades.
-No tiene riesgos graves.
-No requiere una preparación previa antes de la prueba.
-Se recomienda, realizar otras pruebas, para confirmar el tipo de alergia.

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Ambos valores nos indican que existe una posibilidad de alergia, pero hay que tener en cuenta, que estas pruebas, no indican el grado de gravedad de alergia ni el tipo de alérgeno, por el cual se produce la reacción.

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Si la IgE es alta: significa que puede tener algún tipo de alergia.
Si la IgE especifica es alta: sígnica que puede tener un tipo de alergia, con el alérgeno que se realizo la prueba.

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Esta técnica consiste en determinar la IgE, que media las reacciones alérgicas rápidas. Se puede ver a nivel total o nivel específico con un anticuerpo específico.

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Es una técnica que se utiliza para medir la cantidad de sustancia que se encuentra en el suero, en este caso los niveles de triptasa e histamina
Se realiza sobre una superficie, se adhieren anticuerpos y otras moléculas. Finalmente se produce una reacción que cambia de color. El resultado se ve por un aparato especial.

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Se recogen 2 muestras de sangre:
-La 1º muestra ,se recoge  enseguida de haberse producido la reacción alérgica.
-La 2º muestra pasadas las 24/48 horas.
A continuación se centrifuga, para separar el suero, que es el que se va a estudiar los niveles de triptasa e histamina

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-Tubo de muestra sangre.
-Centrifugadora.
-Método enzimomunoensayo fluorimétrico

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Los niveles de triptasa han sido estudiados por varios casos diferentes como :
-Picaduras de insectos.
-Reacción con el látex.
-Ingesta de medicamentos.
-Episodios de hipotensión.
Además es una prueba apta para todas las edades y no tiene ningún riesgo especial, ya que es una extracción de sangre.

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La Histamina es una sustancia que es liberada por los mastocitos como respuesta a una reacción alérgica. Esta causa efectos en el organismo tales como, una dilatación de los vasos sanguíneos  que a su vez va ha ocasionar diversos problemas.
La histamina es usada en las pruebas para diagnosticar diversas patologías.
Este test mide la cantidad de histamina en sangre y orina.
El test precisa de alérgenos naturales.
Para analizar los resultados es importante realizar una curva estándar donde se apunten las cantidades de histamina conocidas y además saber el contenido que tienen los mastocitos.

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Cuando dan unos resultados muy elevados de triptasa, normalmente quiere decir que tiene una reacción alérgica importante. Ya que produce unos síntomas considerables, que pueden producir la muerte.
Él método para detectar la triptasa se considera un fluoroinmunoensayo.

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Positivo: Cuando los niveles de la triptasa son elevados al 11,4%, ese es el valor normal
Negativo: Los niveles se encuentran por debajo en el rango de ese porcentaje.

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En esta técnica, se observa la reacción de la triptasa, es una proteína que produce inflamación y broncoespamos. Esto se da en alergias muy graves. Además se estudia la histamina y las enzimas y factores que regulan al completo.

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Se incuba 30 minutos a 4ºC, protegidos de la luz

Añadimos 4 ml de reactivo de lisis en cada tubo y lo dejamos 5 minutos a Tª ambiente

Se para la lisis celular añadiendo 1 ml de tampón de lavado y se centrifuga 5 minutos a más de 1000 g

Se decanta e sobrenadante y añadimos 500 ml de buffer de lavado en cada tubo

El análisis de marcadores de membrana se hace mediante citometría de flujo y el análisis de los resultados se realiza en un software CellQuest

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Como control positivo se usa un solución de Ac monoclonal Anti IgE Le27. Como control negativo se añade 50 microl de tampón de muestra

Se añade 5o microl de la suspensión celular de la sangre del paciente, se agita y se incuba 40 minutos a 37ºC

Se detiene la reacción añadiendo 100 ml de tampón HEPES sin calcio ni magnesio pero con EDTA

Las placas se centrifugan durante 5 minutos a 4ºC , 1000 g

Los basófilos se marcan añadiendo 20 ml de anticuerpo anti-CD63 PE y anticuerpo anti-IgE FITC.

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Esta técnica se utiliza desde hace algunas décadas, pero la utilización más reciente de citometría de flujo ha mejorado su sensibilidad y especifidad

También es de utilidad en alergia alimentaria para monitorizar la eficacia de la inmunoterapia, en procesos alérgicos que no pueden detectar de manera convencionale la existencia de IgE específica

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Se trata de una técnica para el diagnóstico de alergias in vitro, se basa en la medición del porcentaje de basófilos que se activan en contacto con un alérgeno.
Se usa para el diagnóstico de alergias a determinados fármacos y a ciertos alimentos como el cacahuete.

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Es un test celular e in vitro que se hace para conocer la respuesta alérgica in vitro, determinar y cuantificar la histamina total y basal de un paciente y además, permite saber, las modificaciones en su liberación, causada por un fármaco e incluso saber, qué influencia tiene el mismo sobre ella. Este test nos mide la liberación de histamina al poner en contacto los alimentos con las células inmunológicas.

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1. Se limpia y se desinfecta la zona con alcohol

2. Se marca con un rotulador la zona de la piel que se va a puncionar

3. Manteniendo la piel tensa, se insertará la aguja de manera paralela a la superficie de la piel, lo más superficial posible

4. se inicia inyectando 0,02 - 0,05 ml de solución con alérgenos a una dilución 1:10.000, seguida de 1:1.000 y por último a 1:10. Debido a su sensibilidad, se usan soluciones de Ag más diluidas que en el Prick.

5. Se leen los resultados pasado 15 - 20 min

6. Si se quiere valorar reacciones trdías, se repite la lectura a las 6 horas

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Jeringas desechables de tuberculina de 1 ml

Alcohol

Gasas

Alérgenos estandarizados

Marcadores para rotular

Histamina

Suero fisiológico

Regla con escala milimétrica

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Habón de 3 mm de diámetro, se trata de la pápula inicial, por lo que no ha habido reacción alérgica

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Habón igual o mayor a 5mm y eritema superior a 10 mm de diámetro.

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La lectura de los resultados se realiza pasados 15 o 20 minutos.
Para evaluar reacciones tardías, se repite la lectura a las 6 horas

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Su realización en pacientes muy sensibilizados puede provocar reacciones anafilácticas

Esta prueba también se usa para realizar Test de Autosuero en pacientes con urticaria crónica

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El paciente debe suprimir previamente la medicación antihistamínica 3 días antes de la prueba. Clemastina o Hidroxicina requieren 10 días, y astemizol 40 días.

Debido a la mayor sensibilidad de este método, se utilizan soluciones de antígenos mas diluidas que en el test Prick.

Esta prueba debe hacerse si previamente los resultados del Prick son dudosos y se sospecha que cierto alérgeno provoca reacción en el paciente.

Debe utilizarse suero fisiológico en el control negativo para descartar dermografismo.

Es más sensible pero menos específico que el test Prick y el RAST

Contraindicado en el embarazo por posibles complicaciones y riesgo para el feto

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- Para el control negativo: se usa suero fisiológico, no provoca reacción
- Para el control positivo: se usa histamina que si provoca reacción

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El alérgeno se une a una IgE específica en la superficie de los mastocitos de la piel, provocando la liberación de histamina y otros mediadores, lo que lleva a la formación de un pápula rodeada de eritema, que inicialmente tendra unos 3 mm de diámetro y que irá creciendo en tamaño si la reacción es positiva.
Es necesario utilizar alérgenos estandarizados mediante métodos biológicos recombinantes, si no están estandarizados, el valor predictivo de los resultados es incierto.

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PROTOCOLO TÉCNICA DE ACTIVACIÓN DE BASÓFILOS:

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PROTOCOLO TÉCNICA DE ACTIVACIÓN DE BASÓFILOS:

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Se extraen 6 ml de sangre periférica en tubos ACD y se guardan a 4ºC hasta 24 h

Se centrifugan los tubos durante 10 minutos a 4ºC y a 550 g

se recogen las células separadas en el halo sobre los eritrocitos y se centrifuga 10 minutos a 4ºC a 550g

Se decanta el sobrenadante y se añade 500 microl de tampón HEPES, buffer calcio, denominado tampón de estimulación, a cada tubo, se mezcla y se agita

Se utiliza una placa de poliestireno, se añade al pocillo 50 ml de las diluciones de Ag

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De los maracadores de activación, CD63 ha sido el más estudiado y el que mejor representa un evento de desgranulación anafiláctica

La PBA es una herramienta prometedora para evaluar en clínica las reacciones alérgicas de forma segura al ser in vitro

El uso de antihistamínicos no afecta la expresión de CD63 o CD203c, mientras que en el caso de corticoides orales a concentraciones muy altas, si afecta a la expresión Cd63, pero no a la de CD203c

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Negativo: evalúa la expresión basal de los marcadores de activación, se utiliza el mismo diluyente en el que se encuentra el alérgeno a evaluar
Positivo: consiste en anticuerpos anti-IgE monoclonales o policlonales

El resultado se representa en una gráfica:

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Los basófilos tienen en su membrana anticuerpos IgE, los cuales son los anticuerpos responsables de las reacciones alérgicas de tipo inmediato.
Para diferenciar los basófilos que están activados de los que no  lo están, se utilizan anticuerpos monoclonales que reconocen la proteína CD63, que están en la membrana de los gránulos del basófilo.
Cuando el basófilo se activa, los gránulos, que contienen los mediadores responsables de las manifestaciones alérgicas, vierten su contenido al exterior. La membrana del basófilo pasa a expresar moléculas CD63.
Mediante citometría de flujo se analiza y se cuenta el porcentaje de basófilos activados frente a los que no lo están.

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No existe actualmente tratamiento para esta alergia.
Se pueden evitar los síntomas evitando la carne roja, compuestos animales...

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SÍNDROME ALFA-GAL: ALERGIA A LA CARNE POR UNA GARRAPATA

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SÍNDROME ALFA-GAL: ALERGIA A LA CARNE POR UNA GARRAPATA

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Es un tipo de alergia alimentaria la cual está causada por la picadura de una garrapata.
Hay que destacar que los grupos sanguíneos AB o B tienen un bajo riesgo de padecerla ya que, sus azúcares son similares al alfa-gal.

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ESPERAR 15 MINUTOS PARA VER LOS RESULTADOS

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ESPERAR 15 MINUTOS PARA VER LOS RESULTADOS

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CON LA LANCETA SE PROCEDERÁ A PUNCIONAR LA ZONA SIN APRETAR DEMASIADO, DONDE SE AÑADIERON LOS ALÉRGENOS

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CON LA LANCETA SE PROCEDERÁ A PUNCIONAR LA ZONA SIN APRETAR DEMASIADO, DONDE SE AÑADIERON LOS ALÉRGENOS

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ACREGAR SÓLO UNA GOTA DE LAS SUSTANCIAS ALÉRGENAS EN CADA NÚMERO SEGÚN CORRESPONDA

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ACREGAR SÓLO UNA GOTA DE LAS SUSTANCIAS ALÉRGENAS EN CADA NÚMERO SEGÚN CORRESPONDA

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AÑADIR LOS CONTROLES (HISTAMINA Y GLICEROSALINO)

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AÑADIR LOS CONTROLES (HISTAMINA Y GLICEROSALINO)

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ROTULAR LA ZONA A PUNCIONAR CON UNA ENUMERACIÓN PARA CADA SUSTANCIA ALÉRGENA

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ROTULAR LA ZONA A PUNCIONAR CON UNA ENUMERACIÓN PARA CADA SUSTANCIA ALÉRGENA