# data[].attributes.body
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)es una reaccion enzimatica in vitro que amplifica una secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación del DNA. Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde para generar más, creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de manera exponencial.

# data[].attributes.attachment_caption
La PCR punto final tiene aplicaciones en todos los campos de la biología molecular y la biotecnología, tanto básica como aplicada.

# data[].attributes.body
Estos incluyen:

Análisis y manipulación del DNA.

Pruebas de paternidad.

Construcción de plantas y animales transgénicos.

Dentro de la ciencia forense en la identificación de cadáveres y sospechosos.

Diagnóstico médico de alguna enfermedad o anomalía.

Terapia génica.

Análisis ambiental e identificación de especies.

# data[].attributes.body
Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq-polimerasa, cebadores, ADN molde y nucleótidos. Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.

# data[].attributes.body
Sensibilidad:  es la cantidad mínima de DNA necesaria para que se produzca la amplificación. Hay organismos que son casi imposibles de cultivar en un laboratorio, que la PCR permite detectar en unos niveles bajos. Esto ayuda a reducir falsos negativos, ya que puede darse la posibilidad de que una muestra positiva se de por negativa porque no se dispone de cantidad suficiente para analizarla.

# data[].attributes.attachment_link.readable_text
La reacción en cadena de la polimerasa, abreviada PCR por su nombre en inglés (Polymerase Chain Reaction) se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en laboratorio es muy habitual desde hace muchos años, para usos que van desde la secuenciación del ADN hasta la generación [...]

Última modificación: 13 mayo 2021

La reacción en cadena de la polimerasa, abreviada PCR por su nombre en inglés (Polymerase Chain Reaction) se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en laboratorio es muy habitual desde hace muchos años, para usos que van desde la secuenciación del ADN hasta la generación de perfiles de ADN forense a partir de muestras genéticas, pasando por la identificación de patógenos gracias a la detección de la ausencia o presencia de sus genes.

En este post explicaremos en qué consiste la reacción en cadena de la polimerasa, incluyendo sus principios y sus etapas, y para qué se usa, aparte de detectar la presencia del gen (ARN en este caso) del coronavirus SARS-CoV-2, que causa la COVID-19.

Una emulación de una actividad celular natural

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) nace de la dificultad de estudiar trozos de ADN aislados en análisis moleculares y genéticos que requieren cantidades significativas de material genético. La PCR permite "amplificar" o "fotocopiar" diminutos segmentos de ADN millones de veces, por lo que a menudo se habla de está técnica como uno de los avances científicos más importantes en biología molecular, que valió a su creador, Kary B. Mullis, el Premio Nobel de Química en 1993.

La PCR se basa en una actividad enzimática que en las células de nuestro organismo se produce de forma natural: las ADN polimerasas pueden obtener dos copias idénticas de las cadenas de ADN nuclear, que en la mitosis repartirán a las células hijas. De la misma manera, en está técnica las polimerasas (generalmente las denominadas Taq) podrán replicar, como una fotocopiadora, un fragmento de ADN, en varios ciclos (entre 20 y 35), que son cambios repetidos de temperatura, para obtener una gran cantidad de copias para poder analizar, en una reacción en cadena a la que debe su nombre.

Usos de la reacción en cadena de la polimerasa

Una vez amplificado, el ADN obtenido por PCR se puede usar en muchos procedimientos de laboratorio diferentes. Por ejemplo, la mayor parte de técnicas de mapeo del Proyecto del Genoma Humano se basaban en la PCR.

Además, también se usa para un sinfín de técnicas clínicas y de laboratorio habituales, incluidas las huellas digitales de ADN (pruebas de paternidad o análisis forenses, por ejemplo), detección de microorganismos (bacterias como Salmonella o Listeria en agua o alimentos, Legionella o agua, etc., virus como el sida, la hepatitis o el COVID-19) y el diagnóstico de trastornos genéticos.

Ventajas de la reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa tiene algunas ventajas significativas respecto a los tradicionales cultivos, que son el método que tradicionalmente asociamos a la microbiología: placas de petri y tubos de ensayo colocados en estanterías, microscopio, colocación de los tejidos en placas de cultivo que se introducen en una incubadora y esperar a ver qué crece, de forma lenta pero segura. A menudo este proceso implica ensayo-error, descartando especie tras especie hasta que solo queda una, a través de la observación de sus características y su comportamiento. Por ejemplo, la E. coli y la Pseudomonas aeruginosa tienen células gramnegativas en forma de bastoncillo, por lo que observadas con microscopio se ven similares, pero sólo mediante un cultivo se puede comprobar que la E. coli metaboliza la lactosa.

Sin embargo, las pruebas moleculares como la PCR han aportado algunas ventajas a las pruebas de cultivo. Las principales son:

Qué se necesita para llevar a cabo una PCR

Una plantilla de ADN: en primer lugar se necesita el ADN que se debe copiar, que generalmente se extrae y se purifica de la sangre o de otro tejido.

Cebadores o iniciadores (primers, en inglés): se trata de oligonucleótidos monocatenarios que se unen a la plantilla de ADN por los extremos y sirven para que la polimerasa inicie la reacción para empezar a sintetizar el material genético. Se necesitan dos cebadores para la PCR, cada uno de ellos complementario a una cadena de ADN que queremos amplificar, y delimitan la zona del ADN a amplificar, es decir, que corresponden a:

Una ADN polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa o Pfu): para sintetizar el ADN como hemos explicado.

dNTP (Trifosfatos de desoxirribonucleótidos): los componentes básicos del ADN son 4 tipos de nucleótidos, integrados por 4 bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y timina), por lo que para poder obtener nuevas moléculas de ADN (las copias) son indispensables estos componentes.

Una solución tampón: se trata de la creación de un entorno óptimo para que tenga lugar la reacción en cadena, en el que poder regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o basicidad en las que se produce la síntesis del material genético.

Solución de sal de cloruro de magnesio: el cloruro de magnesio se disocia y se libera magnesio, cuyos iones de carga positiva (+2) se usan como cofactores de la polimerasa.

Además de todos estos ingredientes, la reacción en cadena de la polimerasa implica un proceso de cambios de temperatura (los ciclos) que tienen lugar en un equipo llamado termociclador, que se programa para alterar la temperatura de la reacción cada pocos minutos para permitir la desnaturalización y síntesis del ADN, de manera que el proceso completo finalice en unas pocas horas.

Etapas de la PCR

1. Desnaturalización del ADN

Es el momento en el que la plantilla de ADN de doble cadena se calienta para separarlo en dos cadenas simples.

¿Qué ocurre en esta etapa?

Estas dos cadenas individuales de ADN actuarán como plantillas para la producción de las nuevas cadenas de ADN (las copias).

En esta etapa la temperatura debe mantenerse un tiempo suficiente que garantice que las dos cadenas se hayan separado por completo.

Esta parte suele tardar entre 15 y 30 segundos.

2. Alineación del ADN

Durante esta etapa, se baja la temperatura para permitir que los cebadores (primers) de ADN se adhieran a la plantilla de ADN.

¿Qué ocurre en esta etapa?

Los primers o cebadores son secuencias de ADN que poseen de 20 a 30 bases de longitud, diseñados para complementar secciones cortas de este ADN en cada extremo de la secuencia a copiar.

Estos primers sirven como punto de partida para sintetizar el ADN, ya que la polimerasa solamente puede añadir bases de ADN a una doble hebra, es decir, que sólo cuando el primer se ha unido a la secuencia, la polimerasa puede unirse y empezar a generar la nueva hebra complementaria de ADN, a partir de bases sueltas.

Este paso suele tardar entre 10 y 30 segundos.

3. Ampliación del ADN

Es el paso final, la parte en la que la temperatura aumenta y la nueva cadena de ADN es producida por la enzima polimerasa Taq.

¿Qué ocurre en esta etapa?

El calor se incrementa a 72ºC para permitir que el nuevo.

Como resultado obtendremos una nueva cadena de ADN y una molécula de ADN de doble cadena.

Este paso puede tardar alrededor de un minuto (para copiar 1.000 bases de ADN), aunque esto depende de la longitud de la secuencia de ADN que se va a amplificar.

Repeticiones

La reacción en cadena de la polimerasa requiere repetir estos tres procesos o ciclos térmicos de 20 a 40 veces, duplicando el número de copias de ADN cada vez.

¿Qué ocurre en cada repetición?

Los nuevos fragmentos de ADN que se generan durante la PCR a su vez sirven como plantillas a las que la polimerasa puede unirse y comenzar a generar más ADN.

El resultado es un gran número de copias de un segmento de ADN concreto obtenidas en un periodo de tiempo mucho más corto que otro tipo de técnicas, unas pocas horas o incluso menos si se trata de una PCR con máquinas de alta velocidad.

Tipos de reacción en cadena de la polimerasa

Hoy en día existen numerosas variaciones de la reacción en cadena de la polimerasa, según el objetivo y los requisitos que se tenga. Las más habituales son:

PCR anidada

Está variación de la reacción en cadena de la polimerasa se usa cuando se quiere incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Por eso se duplica el paso de la amplificación con distintos pares de primers en cada uno. Primero se lleva a cabo una reacción en cadena con los cebadores externos para amplificar la parte más extensa de ADN, que contiene el segmento que tenemos por objetivo, y luego está amplificación se usa como ADN plantilla de una segunda PCR con cebadores internos para copiar ese segmento específico.

PCR in situ

Se suele usar para detectar cadenas de ADN dentro de células que con otras técnicas no se pueden detectar, por lo que se hace en tejidos. En contrapartida tiene menor capacidad de amplificación.

PCR múltiple

En esta variante se usan varias parejas de cebadores en una misma reacción en cadena para varias ampliaciones. Cada pareja corresponde a un virus distinto, y así se puede detectar una misma reacción de varios patógenos a la vez, como por ejemplo diferentes virus respiratorios.

RT-PCR (con transcriptasa inversa)

Es la que se lleva a cabo en el diagnóstico de virus como el SARS-CoV-2 que causa la COVID-19. Este tipo de PCR es necesario para virus que tienen genoma de ARN, que requieren un paso adicional en el proceso: después de aislar y purificar el ARN, se usa la transcriptasa inversa (llamada también RT, por sus siglas en inglés, Reverse Transcription) para sintetizar una molécula de ADN complementario que sirve de inicio para la PCR convencional.

Consta, por lo tanto, de tres pasos:

Primer paso: retrotranscripción a partir del ARN.

Segundo paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.

Tercero paso: PCR estándar.

PCR en tiempo real o cuantitativa

La ventaja principal de esta PCR es que permite monitorizar (medir) en tiempo real la cantidad de fragmentos de material genético que se van produciendo, es decir, durante cada ciclo de amplificación, y no al final, sin sacrificar la precisión. Se requieren reactivos fluorescentes y un termociclador que mide la fluorescencia en un momento concreto de cada ciclo de amplificación. Esto es especialmente interesante si lo que se desea testar es un microorganismo en alimentos muy perecederos o de vida útil corta.

PRC de células viables.

Como paso previo a la amplificación del fragmento de ADN diana, la muestra se somete a una neutralización del material genético "libre" en la suspensión, o el procedente de células dañadas o muertas. Con este paso inicial, los resultados de la PRC evidenciarán solamente la presencia de células vivas presentes en nuestra muestra.

Aconsa, laboratorio especializado en PCR alimentarias y de aguas

Si requieres una prueba de diagnóstico en laboratorio como la reacción en cadena de la polimerasa, contáctanos y te asesoramos. Podemos ofrecerte PCR en tiempo real para la detección de Legionella en todo tipo de aguas. Además nuestra técnica nos permite identificar exclusivamente las células de Legionella que están vivas, y emitimos el resultado cuantificando las unidades genómicas detectadas, y su correlación con las ufc/l. De este modo, nos alineamos con las normas UNE 100030 y el RD865/2003. Puedes acceder al 'paper' vía subscripción donde describimos esta tecnología pinchando aquí.

# data[].attributes.attachment_link.title
Reacción en cadena de la polimerasa: qué es la PCR más allá de su uso por la COVID-19 - Aconsa

# data[].attributes.attachment_link.description
La reacción en cadena de la polimerasa, abreviada PCR por su nombre en inglés (Polymerase Chain Reaction) se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en laboratorio es muy habitual desde hace muchos años, para usos que van desde la secuenciación del ADN hasta la generación [...]

# data[].attributes.body
La especificidad: es la obtención de un solo producto amplificado. Esta depende, fundamentalmente, de la temperatura empleada en la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reacción (además de depender de la secuencia de los cebadores). Por una parte, cuanto mayor sea la temperatura utilizada en la fase de hibridación, más específica es la reacción. Esto se debe a que a mayor temperatura más dificultada se ve la unión entre el cebador y la cadena molde; en condiciones de temperaturas de hibridación elevadas el cebador sólo se unirá a la cadena molde si son complementarios en todos sus nucleótidos.

# data[].attributes.body
La Eficiencia es la amplificación máxima que se puede obtener con un número determinado de ciclos, se refiere a la cantidad de producto obtenido.
Factores que pueden llevar al plateau:
• La disminución de sustratos, cebadores o dNTPs (degradación de los reactivos: enzima, etc.)
• La estabilidad de los reactivos‐ estabilidad de la enzima
• Inhibición por productos finales (formación de PPi)
• Competencia por reactivos, por productos no específicos o dímeros de los primers
• Re‐anillado del producto a altas concentraciones las cuales previenen la extensión del proceso (10nM)
• Incompleta desnaturalización en concentraciones altas de producto

# data[].attributes.body
La fidelidad de la replicación del ADN está basada en el reconocimiento molecular de sus componentes, los nucleótidos, durante la síntesis de secuencias complementarias en la doble hélice.

Para mejorar la fidelidad del la PCR se necesita:
• Seleccionar una enzima con actividad 3’-5’ exonucleasa.
• Utilizar iniciadores con más de 15 nucleótidos.
• Incrementar la temperatura de alineamiento.
• Reducir el tiempo de desnaturalización y alineamiento en el ciclo.
• Reducir la concentración de iniciadores.
• Reducir el número de ciclos.
• Reducir la concentración de Mg2+.
• Revisar que el termociclador funcione adecuadamente.

# data[].attributes.headline
VENTAJAS (Díaz, Rentería, Cortez, Sierra. 2013)

# data[].attributes.subject
VENTAJAS (Díaz, Rentería, Cortez, Sierra. 2013)

# data[].attributes.body
*Permite generar millones de copias de la   región de interés a partir de una o muy pocas copias del ADN molde.
*Es una técnica muy confiable debido, en gran medida, a la gran capacidad de los oligonucleótidos, en este caso de los iniciadores de unirse con firmeza.
*La unión de oligonucleótidos se da específicamente a sus secuencias complementarias de ADN.
*Discrimina fácilmente entre centenares de millares de sitios de unión.

# data[].attributes.body
*Es necesario de estandarizar la técnica para el Organismo que se va ha estudiar en específico.
*Depende de la técnica de interés y requiere una estandarización en base a la técnica elegida.
*La cantidad de tiempo que el proceso de estandarización requiere puede hacer que sea tardado.
*Puede resultar mas costosa que otras técnicas debido a los materiales y tecnología que requiere.

# data[].attributes.attachment_link.title
Qué es una PCR explicado para mayores y niños

# data[].attributes.body
-Díaz A., Rentería L., Cortez J. Sierra E. (2013). PCR: reacción en cadena de la polimerasa. Departamento de Hidrobiología. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. Instituto de Ecología, Universidad Nacional Autónoma de México. Laboratorio de Biología Molecular, Centro Nacional de Investigación y Capacitación. Ambiental, Instituto Nacional de Ecología. Universidad Autónoma de la Ciudad de México. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf

-Orellano, E. G., & Biotecnología, L. (s/f). Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Recuperado el 24 de febrero de 2022, de Edu.ar website: https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/176470/mod_folder/content/0/PCR%20EO%20Biotec%20LB%202019.pdf?forcedownload=1

-Pérez de Castro, A. M. (s/f). Reacción en cadena de la polimerasa. Recuperado el 24 de febrero de 2022, de Upv.es website: https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf
-Biogenetix Lab. Que es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR en punto final). (2020). Disponible en: https://www.biogenetixlab.com/blog/que-es-pcr-reaccion-cadena-polimerasa/#:~:text=Blog-,%C2%BFQu%C3%A9%20es%20la%20Reacci%C3%B3n%20en%20Cadena%20de,Polimerasa%20(PCR%20punto%20final)%3F&text=La%20Reacci%C3%B3n%20en%20Cadena%20de%20la%20Polimerasa%20(PCR%2C%20Polymerase%20Chain,cadenas%20y%20replicaci%C3%B3n%20del%20DNA.
- Dios L, Tamay. Ibarra, C. Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. (2013). Disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf

# data[].attributes.attachment_link.readable_text
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplifica una secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación del DNA.

Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde para generar más, creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de manera exponencial.

La PCR ha revolucionado la biología debido a su capacidad de utilizar cantidades infinitesimalmente pequeñas de DNA y amplificarlo en cantidades susceptibles de análisis utilizando a la enzima DNA polimerasa, que es la encargada de sintetizar nuevas copias de DNA.

¿Cómo funciona la PCR?

La PCR típica en realidad, amplifica solo una región o secuencia diana elegida dentro de una muestra compleja de DNA mediante dos pequeñas moléculas de DNA monocatenario llamados iniciadores (primers o cebadores) de PCR.

Los iniciadores de PCR son la clave para amplificar solo una secuencia diana definida de una muestra compleja, incluso tan compleja como una muestra de DNA aislada de suelo o agua, que puede contener millones de fragmentos diferentes de DNA de los microbios que habitan estos entornos.

Ciclos de la PCR.

Esta técnica de PCR, conocida también como PCR punto final, se puede resumir como en la imagen anterior. Primero, se extrae el DNA bicatenario que contiene la región diana y luego se calienta hasta que se vuelve monocatenaria. A continuación, los iniciadores de PCR se parean al principio y al final de la región objetivo. Finalmente, la DNA polimerasa hace copias de la región diana.

El primer paso en la PCR es mezclar los siguientes componentes o ingredientes en un tubo:

1. La molécula de DNA original o el DNA diana en una pequeña cantidad es suficiente. El DNA diana puede ser parte de una muestra de DNA compleja, que contiene múltiples genomas de diferentes organismos, pero también podría ser tan simple como un fragmento de DNA previamente amplificado por PCR.

2. Se necesitan dos iniciadores de PCR para comenzar la síntesis de DNA. Estos son fragmentos cortos de DNA monocatenario que son complementarios a las secuencias en cada extremo del segmento de DNA diana. Estos iniciadores se obtienen mediante síntesis química de DNA.

3. Se necesita DNA polimerasa para sintetizar las copias de DNA. La PCR implica varios pasos de alta temperatura, por lo que se requiere una DNA polimerasa resistente al calor. Las polimerasas termoestables se aíslan de bacterias que viven en ambientes a temperaturas de hasta 90 ºC o más. La DNA polimerasa Taq de Thermus aquaticus es la más usada, pero muchas especies diferentes de bacterias termófilas han proporcionado características mejoradas para realizar copias de una secuencia de DNA diana durante la PCR.

4. La DNA polimerasa necesita un suministro de nucleótidos, o bloques de construcción para el nuevo DNA, con el objetivo de sintetizar las nuevas copias. Estos se suministran como desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP).

5. Una solución amortiguadora o tampón que contiene las concentraciones adecuadas de iones y pH que garantizan las condiciones óptimas.

El segundo paso de la PCR es colocar el tubo con los ingredientes en una máquina especial llamada máquina de PCR o termociclador, que es capaz de alternar la temperatura del tubo de reacción de PCR de forma rápida y precisa.

El termociclador alterna la temperatura desde un máximo de 95 °C hasta un mínimo de 4 °C. Normalmente, una reacción de PCR se realizará en 20-40 ciclos con tres temperaturas diferentes en cada uno de los ciclos. Cada ciclo consta de una temperatura de desnaturalización, una temperatura de alineamiento y finalmente una temperatura de extensión.

Programa típico de termociclado para PCR.

De todos los avances técnicos en biología molecular moderna, la PCR es uno de los más útiles; de hecho, la PCR es lo suficientemente sensible como para amplificar el DNA de una sola célula.

Aplicaciones de PCR punto final

No es sorprendente que la PCR haya encontrado aplicaciones en todos los campos de la biología molecular y la biotecnología, tanto básica como aplicada. Estos incluyen análisis y manipulación de DNA, construcción de plantas y animales transgénicos, ciencia forense, diagnóstico médico, terapia génica y análisis ambiental.

En teoría, la PCR amplifica el DNA de manera exponencial, duplicando el número de moléculas diana con cada ciclo de amplificación. Cuando se desarrolló por primera vez, los científicos razonaron que el número de ciclos y la cantidad de producto final de la PCR podrían usarse para calcular la cantidad inicial de material genético en comparación con un estándar conocido. Para abordar la necesidad de una cuantificación sólida, se desarrolló la técnica de PCR en tiempo real.

Actualmente, una aplicación principal de la PCR de punto final es amplificar DNA específico para secuenciar, clonar y usar en distintas técnicas de biología molecular.

# data[].attributes.attachment_link.title
¿Qué es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR punto final)?

# data[].attributes.attachment_link.description
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplifica una secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación del DNA. Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde para generar más, creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de manera exponencial.